GRGDSPC多肽表面修飾PET人工韌帶促進(jìn)腱骨愈合的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、[背景]
　　 對(duì)于重建膝關(guān)節(jié)交叉韌帶損傷的材料有多種，但各自均有優(yōu)缺點(diǎn)。聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯(PET)人工韌帶具有力學(xué)性能良好，取材方便，手術(shù)簡(jiǎn)單，術(shù)后康復(fù)快等優(yōu)點(diǎn)，是一種具有良好應(yīng)用前景的移植材料。但PET人工韌帶在骨隧道內(nèi)能否達(dá)到“腱骨愈合”可能影響交叉韌帶重建的遠(yuǎn)期療效。雖然文獻(xiàn)報(bào)道應(yīng)用LARS人工韌帶重建術(shù)后的近期療效良好，但遠(yuǎn)期療效尚不明確。LARS人工韌帶為PET惰性材料，PET材料與骨界面是否能最終達(dá)到生物性愈合

2、，對(duì)于應(yīng)用PET人工韌帶重建交叉韌帶術(shù)后的遠(yuǎn)期療效具有重要意義。本研究通過應(yīng)用多肽表面修飾PET材料，促進(jìn)PET材料與細(xì)胞的組織相容性，進(jìn)一步觀察其在體內(nèi)與骨界面的生物性愈合情況，初步探討PET人工韌帶與骨界面實(shí)現(xiàn)生物性愈合的可行性。
　　 [目的]
　　 1.通過回顧性分析應(yīng)用LARS人工韌帶重建前交叉韌帶術(shù)后患者的骨隧道變化特點(diǎn)及可能的影響因素，初步探討人工韌帶與骨界面的結(jié)合情況，為下一步研究人工韌帶“腱骨愈合”打下

3、基礎(chǔ)。2.應(yīng)用GRGDSPC多肽表面修飾PET材料，初步探討實(shí)現(xiàn)PET材料與GRGDSPC多肽實(shí)現(xiàn)高效共價(jià)結(jié)合的簡(jiǎn)單易行的操作方法。3.將表面修飾后的PET材料與骨髓間充值干細(xì)胞體外共培養(yǎng)，探討GRGDSPC表面修飾PET材料后促進(jìn)其生物相容性的有效性。4.將GRGDSPC表面修飾后的PET材料植入體內(nèi)，初步觀察PET材料與骨界面的生物性愈合情況，為將來實(shí)現(xiàn)臨床應(yīng)用提供依據(jù)。
　　 [方法]
　　 1.2004年8月至2

4、007年4月對(duì)43例應(yīng)用LARS人工韌帶重建ACL患者（其中男31例，女12例;左膝19例，右膝24例;平均年齡為27.5歲）進(jìn)行3年的隨訪，于術(shù)后1、3、6、12、24、36個(gè)月分別進(jìn)行X線和CT檢查，記錄各個(gè)時(shí)間段脛骨和股骨骨道的寬度。以Lysholm評(píng)分測(cè)定膝關(guān)節(jié)功能，以KT-1000測(cè)量膝關(guān)節(jié)的松弛度。
　　 2.分別應(yīng)用NaOH堿性水解方法處理PET材料及應(yīng)用H2SO4和KMnO4處理PET材料。將處理后的PET材料及

5、未經(jīng)處理的PET材料分別與不同溶度的GRGDSPC多肽溶液進(jìn)行結(jié)合，采用傅里葉變紅外光譜分析及X線衍射分析技術(shù)，分析其共價(jià)結(jié)合效果和多肽結(jié)合含量。
　　 3.分別將表面修飾的PET材料和未經(jīng)處理的PET材料與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)，掃描電鏡下分別觀察細(xì)胞的粘附和增殖情況，細(xì)胞血球板計(jì)數(shù)法測(cè)定細(xì)胞的粘附率。同時(shí)應(yīng)用細(xì)胞茜素紅染色法及堿性磷酸酶法鑒定骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨誘導(dǎo)分化。
　　 4.選用新西蘭兔建立前交叉韌帶損傷動(dòng)

6、物模型，分別將表面修飾的PET材料和未經(jīng)處理的PET材料植入動(dòng)物體內(nèi)，在不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)上采用HE染色法和掃描電鏡觀察PET材料與骨界面的結(jié)合情況。
　　 [結(jié)果]
　　 1.隨訪時(shí)間為36～49個(gè)月，平均39.5個(gè)月。按照Peyrache等提出的分級(jí)方法(0級(jí)＜2mm，1級(jí)2～4 mm，2級(jí)4～6 mm，3級(jí)≥6mm)，僅3例出現(xiàn)了骨道1級(jí)擴(kuò)大，均為術(shù)后6個(gè)月發(fā)生在股骨隧道，未發(fā)現(xiàn)2級(jí)和3級(jí)骨道擴(kuò)大，3例骨道擴(kuò)大部分均位于

7、股骨隧道近關(guān)節(jié)面水平，平均擴(kuò)大(2.5±0.3) mm。40例0級(jí)擴(kuò)大患者至末次隨訪時(shí)，脛骨骨道平均增寬為(0.8±0.3) mm，股骨骨道平均增寬為(1.1±0.3) mm。不同時(shí)間段骨道寬度的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。X線與CT測(cè)量結(jié)果基本一致。末次隨訪時(shí)，3例骨道1級(jí)擴(kuò)大病例Lysholm評(píng)分平均為(94.5±4.6)分，KT-1000前移差值平均為(1.5±1.1)mm;40例0級(jí)擴(kuò)大病例Lysholm評(píng)分平均為(95.

8、6±4.8)分，KT-1000前移差值平均為(1.4±1.5) mm。
　　 2.采用NaOH堿性水解方法處理PET材料方法簡(jiǎn)便可靠，效率較高。應(yīng)用H2SO4和KMnO4處理PET材料及單純將PET材料與GRGDSPC多肽混合，并無法實(shí)現(xiàn)與GRGDSPC多肽共價(jià)結(jié)合。堿性水解法處理的PET材料與GRGDSPC多肽的結(jié)合效果最佳。FTIR提示7.5mg/ml的GRGDSPC多肽濃度與材料共價(jià)結(jié)合的效率較好，增加GRGDSPC多肽濃

9、度后，其共價(jià)結(jié)合效率提高并不明顯。XPS提示:7.5mg/ml的GRGDSPC多肽表面修飾的PET材料氮元素含量達(dá)2.43％，而未經(jīng)處理的PET材料分別與7.5mg/ml，12 mg/ml和3 mg/ml的GRGDSPC多肽混合后的氮元素含量分別為1.99％，1.96％，1.42％。
　　 3.新西蘭兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞實(shí)現(xiàn)成功的分離、傳代培養(yǎng)、冷凍保存、復(fù)蘇及誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與PET材料共培養(yǎng)后實(shí)現(xiàn)了早期粘附

10、和增殖，隨著時(shí)間的增長(zhǎng)，各組材料的細(xì)胞粘附率均提高，培養(yǎng)48小時(shí)后，GRGDSPC多肽表面修飾的PET材料對(duì)細(xì)胞的粘附率顯著增高，其次為GRGDSPC多肽混合PET材料組，最次為未處理PET材料組。
　　 4.新西蘭兔膝關(guān)節(jié)交叉韌帶損傷模型建立后，將各種處理?xiàng)l件的PET材料植入體內(nèi)。隨著造模時(shí)間的延長(zhǎng)，應(yīng)用GRGDSPC多肽表面修飾的PET組效果最好，PET材料與組織結(jié)合緊密，且結(jié)合量很多。其次為GRGDSPC多肽混合PET材料

11、組，PET材料與組織結(jié)合部分緊密，材料空隙間結(jié)合量少;最次為未處理PET材料組，僅少量PET與組織結(jié)合。HE染色提示表面修飾后的PET材料表面有大量的成纖維細(xì)胞粘附增殖，而未處理PET材料材料表面僅有少量的細(xì)胞粘附生長(zhǎng)。
　　 [結(jié)論]
　　 LARS人工韌帶重建前交叉韌帶術(shù)后，骨道擴(kuò)大并不明顯，這種變化特點(diǎn)間接提示了人工韌帶在骨道內(nèi)并沒有經(jīng)歷類似自體移植物那樣的組織壞死及對(duì)骨道壁的再塑形過程，雖然人工韌帶與骨道的結(jié)合情

12、況尚不清楚，但進(jìn)一步研究促進(jìn)人工韌帶與骨界面的生物性愈合具有重要意義。應(yīng)用NaOH堿性水解方法處理PET材料方法簡(jiǎn)便可靠，效率較高，堿性水解法處理后的PET材料與GRGDSPC多肽實(shí)現(xiàn)了共價(jià)結(jié)合，GRGDSPC多肽表面修飾的PET材料可明顯提高材料與細(xì)胞的粘附和增殖，體內(nèi)試驗(yàn)證明表面修飾后的PET材料與組織結(jié)合更緊密，成纖維細(xì)胞的含量更多。但PET人工韌帶與骨界面的結(jié)合情況仍需延長(zhǎng)動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)時(shí)間，以進(jìn)一步觀察其是否最終實(shí)現(xiàn)生物性結(jié)合。