Kartogenin復(fù)合海藻酸鹽凝膠促進(jìn)大鼠前交叉韌帶重建后腱骨愈合的研究.pdf

1、目的：
　　前交叉韌帶(Anterior cruciate ligament，ACL)損傷是膝關(guān)節(jié)最常見的一種韌帶損傷，每年導(dǎo)致全球范圍內(nèi)大約400，000人進(jìn)行ACL重建手術(shù);因ACL不能自行愈合，臨床上通常選用自體或異體移植物進(jìn)行外科重建，以期恢復(fù)正常的膝關(guān)節(jié)運(yùn)動(dòng)學(xué)及防止退行性骨關(guān)節(jié)炎(Osteo arthritis，OA)發(fā)生。ACL通過被稱為“腱止點(diǎn)”的過渡結(jié)構(gòu)附著于骨組織上;腱止點(diǎn)典型的四層結(jié)構(gòu)，是由肌腱、纖維軟骨、鈣化

2、的纖維軟骨和骨四層區(qū)域組成，成熟的纖維軟骨界面在分散應(yīng)力集中過程中起著重要的作用。因此，ACL重建的關(guān)鍵是怎樣有效的再生正常的纖維軟骨腱止點(diǎn)結(jié)構(gòu)。
　　通過譜系示蹤的研究表明，位于軟骨和肌腱/韌帶之間的連接結(jié)構(gòu)起源于Scx/Sox9表達(dá)陽性的一群祖細(xì)胞。Sox9是HMG盒區(qū)內(nèi)的一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，在調(diào)節(jié)軟骨形成過程中起著重要作用。與此同時(shí)，另一項(xiàng)研究表明，Sox9能誘導(dǎo)肌腱細(xì)胞直接轉(zhuǎn)換為軟骨細(xì)胞。以上研究表明，成軟骨誘導(dǎo)因子可能在促進(jìn)腱

3、-骨界面愈合過程中起著重要作用;數(shù)項(xiàng)研究（如利用BMP-2，TGF-β3，PTH等）也證明，成軟骨誘導(dǎo)因子在一定程度上具有改善腱-骨愈合的功能。
　　軟骨在腱止點(diǎn)發(fā)育過程中起著如此重要的作用，本文主要的目的是從形態(tài)學(xué)上觀察軟骨在腱止點(diǎn)發(fā)育過程中起到的作用，然后建立一個(gè)ACL重建的小動(dòng)物腱-骨愈合模型，利用這個(gè)模型研究具有成軟骨分化作用的小分子kartogenin(KGN)潛在的促進(jìn)腱止點(diǎn)愈合能力。KGN是一種小分子雜環(huán)化合物，有研

4、究證明其具有很強(qiáng)的促進(jìn)內(nèi)源性干細(xì)胞/祖細(xì)胞如間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)分化為軟骨細(xì)胞功能。
　　本實(shí)驗(yàn)旨在建立SD大鼠前交叉韌帶重建模型，利用建立的小動(dòng)物模型，研究具有促軟骨分化能力的小分子雜環(huán)化合物KGN復(fù)合海藻酸鹽凝膠對腱-骨愈合的作用。
　　方法：
　　1、選用6個(gè)時(shí)間點(diǎn)的SD大鼠，觀察岡上肌腱止點(diǎn)的形態(tài)學(xué)特點(diǎn)。
　　利用大鼠岡上肌腱止點(diǎn)模型，觀察腱止點(diǎn)附著結(jié)構(gòu)發(fā)

5、育形成過程;觀察不同年齡段大鼠腱止點(diǎn)發(fā)育過程中細(xì)胞外基質(zhì)和結(jié)構(gòu)變化特點(diǎn)。3、7、4、21、28和56天齡大鼠各3只用于岡上肌腱止點(diǎn)取材;標(biāo)本作5μm厚的石蠟切片，然后利用番紅O和HE染色觀察腱止點(diǎn)發(fā)育。
　　2、建立ACL重建的腱-骨愈合小動(dòng)物模型。
　　6只健康雄性SD大鼠（骨骼成熟，體重340-360g;年齡小于3月）利用自體趾長屈肌腱（flexor digitorum longus，F(xiàn)DL）移植物進(jìn)行單側(cè)ACL重建。1

6、只動(dòng)物術(shù)后當(dāng)天取材，進(jìn)行顯微斷層掃描(micro-computed tomography，Micro-CT);剩余動(dòng)物術(shù)后第4周取材，行Micro-CT掃描、生物力學(xué)檢測、組織形態(tài)學(xué)分析。
　　3、KGN復(fù)合海藻酸鹽凝膠促進(jìn)大鼠腱-骨界面愈合的研究。
　　15只雄性SD大鼠分為兩組：右膝為添加含KGN海藻酸鹽凝膠實(shí)驗(yàn)組，左膝為海藻酸鹽空白組。雙側(cè)膝關(guān)節(jié)均接受自體FDL移植物重建ACL手術(shù)，分別于第2、4、8周麻醉后處死5只取

7、材，行Micro-CT掃描和組織形態(tài)學(xué)分析觀察骨隧道變化和腱-骨界面纖維軟骨形成情況。
　　結(jié)果：
　　1.SD大鼠岡上肌腱止點(diǎn)在3、7天齡時(shí)，可見大量軟骨細(xì)胞聚集，無典型的腱止點(diǎn)四層結(jié)構(gòu);腱-骨界面直到出生21天以后，才出現(xiàn)典型成熟的纖維軟骨止點(diǎn);腱止點(diǎn)分層礦化界面的發(fā)育與腱止點(diǎn)附近的軟骨內(nèi)骨成骨密切相關(guān)。
　　2.本實(shí)驗(yàn)成功的構(gòu)建了ACL重建的小動(dòng)物研究模型;所有的大鼠對手術(shù)耐受良好，幾乎沒有出現(xiàn)并發(fā)癥;從FDL取