應(yīng)用SELDI-TOF-MS篩選子宮內(nèi)膜異位癥及子宮腺肌病在位內(nèi)膜線粒體差異蛋白的研究.pdf

1、子宮內(nèi)膜異位癥(endometriosis，EMs)是生育年齡婦女常見(jiàn)的良性疾病，它又可浸潤(rùn)病灶周圍的正常組織，治療后易于復(fù)發(fā)，具有一定的“惡性”行為，近年來(lái)發(fā)病率有逐年升高趨勢(shì)，成為婦科疾病中的熱點(diǎn)問(wèn)題。內(nèi)異癥病因與發(fā)病機(jī)制至今未明，經(jīng)血逆流、種植以及腹膜或間皮細(xì)胞化生是兩種被廣泛接受的學(xué)說(shuō)，其中以Sampson的經(jīng)血逆流種植學(xué)說(shuō)為主導(dǎo)理論。經(jīng)血逆流是婦女月經(jīng)期常見(jiàn)的現(xiàn)象，可發(fā)生于80％-90％的月經(jīng)周期，但臨床上僅10％-15％育齡

2、婦女罹患內(nèi)異癥，這是Sampson學(xué)說(shuō)無(wú)法解釋之處。新近的研究焦點(diǎn)聚焦于子宮在位內(nèi)膜，有謂“在位內(nèi)膜決定論”。有研究也表明內(nèi)異癥患者在位內(nèi)膜的一些生物因子表達(dá)異常，有別于正常子宮內(nèi)膜，使其具有更強(qiáng)的粘附和侵襲能力。
　　 約有30％的子宮內(nèi)膜異位癥患者同時(shí)合并子宮腺肌病(adenomyosis)，子宮腺肌病也是發(fā)生于女性生殖系統(tǒng)常見(jiàn)的良性病變，隨著診斷水平的提高，其發(fā)病率也呈上升趨勢(shì)。子宮腺肌病的發(fā)病機(jī)理尚未達(dá)成一致，其中被普遍

3、接受的假說(shuō)是：子宮腺肌病起源于子宮內(nèi)膜基底層，由于某些特異性酶的作用，子宮肌層的平滑肌纖維束間失去緊密的連接，同時(shí)基底層內(nèi)陷，高水平雌孕激素刺激也可能是促進(jìn)子宮內(nèi)膜向肌層生長(zhǎng)的原因之一。可見(jiàn)，在位內(nèi)膜的侵襲性增強(qiáng)和肌層薄弱是子宮腺肌病形成的兩大重要要素。約15％的子宮腺肌病同時(shí)合并子宮內(nèi)膜異位癥，以往認(rèn)為子宮腺肌病是內(nèi)在性的子宮內(nèi)膜異位癥，但研究發(fā)現(xiàn)其發(fā)病機(jī)制和病理特點(diǎn)有別于外在性的子宮內(nèi)膜異位癥，故有的學(xué)者建議將子宮腺肌病作為一種獨(dú)立

4、性的疾病進(jìn)行研究.
　　 子宮內(nèi)膜異位癥和子宮腺肌病的發(fā)病機(jī)制至今不明，診斷的金標(biāo)準(zhǔn)仍然依賴手術(shù)或病理檢查，因此臨床診斷困難，但其臨床癥狀和并發(fā)癥卻對(duì)女性健康和生育卻有著重大的影響。探討子宮內(nèi)膜異位癥和子宮腺肌病的發(fā)病機(jī)制，尋找微創(chuàng)、靈敏、特異的標(biāo)志物成為基礎(chǔ)研究向應(yīng)用研究過(guò)渡的熱點(diǎn)之一。
　　 線粒體不僅是機(jī)體的能量代謝中心，而且還參與多種重要的細(xì)胞病理過(guò)程。線粒體也有可能成為癌癥和其他疾病早期篩查、風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和診斷的新

5、標(biāo)志物，同時(shí)為尋找新的治療靶點(diǎn)和疾病干涉手段提供基礎(chǔ)。以往的研究中，子宮內(nèi)膜異位癥和子宮腺肌病的線粒體功能變化研究甚少，僅有少量研究表明，氧化應(yīng)激和線粒體DNA突變可能參與了內(nèi)異癥的發(fā)生和發(fā)展，而子宮內(nèi)膜異位癥和子宮腺肌病線粒體蛋白組學(xué)水平的研究，至今鮮有報(bào)道。
　　 蛋白質(zhì)而并非核酸才是生命活動(dòng)的具體執(zhí)行者和體現(xiàn)者，因此深入研究子宮內(nèi)膜異位癥和子宮腺肌病的發(fā)病機(jī)制，尋找微創(chuàng)、特異、靈敏的標(biāo)志物用于早期診斷和隨訪監(jiān)測(cè)，客觀上要求

6、在蛋白質(zhì)組的水平進(jìn)行進(jìn)一步探索。近年來(lái)開展的表面增強(qiáng)激光解吸-電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜(SELDI-TOF-MS)技術(shù)為這一探索提供了優(yōu)良的技術(shù)平臺(tái)。這一方法最大的優(yōu)勢(shì)在于高通量、高靈敏度的實(shí)現(xiàn)了質(zhì)譜技術(shù)對(duì)臨床樣本的直接檢測(cè)。
　　 本課題旨在應(yīng)用SELDI-TOF-MS和生物信息學(xué)技術(shù)從子宮在位內(nèi)膜中篩選子宮內(nèi)膜異位癥和子宮腺肌病的差異表達(dá)線粒體蛋白并構(gòu)建診斷模型；并將得到的線粒體差異蛋白與血清和內(nèi)膜總蛋白標(biāo)志物進(jìn)行對(duì)比，以期找到適

7、合子宮內(nèi)膜異位癥和子宮腺肌病早期診斷、監(jiān)測(cè)的候選標(biāo)志物，為其分離、純化、解碼等進(jìn)一步研究提供資源和基礎(chǔ)，為探索子宮內(nèi)膜異位癥和子宮腺肌病的發(fā)病機(jī)制和治療靶點(diǎn)提供新思路。
　　 第一部分：應(yīng)用SELDI-TOF-MS篩選子宮內(nèi)膜異位癥在位內(nèi)膜線粒體差異蛋白的研究
　　 目的：篩選子宮內(nèi)膜異位癥在位內(nèi)膜線粒體差異蛋白，并建立檢測(cè)模型。
　　 方法：采用SELDI-TOF-MS技術(shù)檢測(cè)24例內(nèi)異癥在位內(nèi)膜和29例對(duì)照患

8、者正常內(nèi)膜組織中線粒體蛋白，并用支持向量機(jī)方法建立判別模型，用留一法評(píng)估模型的預(yù)測(cè)效果：采用卡方檢驗(yàn)檢驗(yàn)各類模型間特異度和靈敏度的差異，t檢驗(yàn)檢驗(yàn)不同臨床分期間蛋白質(zhì)峰值表達(dá)差異。
　　 結(jié)果：1.內(nèi)異組在位內(nèi)膜/對(duì)照組正常內(nèi)膜組織間共檢測(cè)到線粒體蛋白質(zhì)峰78個(gè)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異蛋白質(zhì)峰10個(gè)(P＜0.05)，其中5，574 m/z和9，378 m/z兩個(gè)蛋白質(zhì)峰在內(nèi)異組中的表達(dá)低于對(duì)照組，其余8個(gè)蛋白質(zhì)峰在內(nèi)異組呈現(xiàn)高表達(dá)；

9、5，574、7，573和7，965m/z三個(gè)蛋白質(zhì)峰出現(xiàn)在增殖期，其它7個(gè)蛋白質(zhì)峰均出現(xiàn)在分泌期。
　　 2.3個(gè)線粒體蛋白質(zhì)峰（15，334，15，128和16，069 m/z）組合所構(gòu)建的診斷模型（模型1）鑒別內(nèi)異癥患者的特異度為86.2％，靈敏度為87.5％。
　　 3.分泌期內(nèi)異組在位內(nèi)膜/對(duì)照組正常內(nèi)膜組織間共檢測(cè)到線粒體蛋白質(zhì)峰69個(gè)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異蛋白質(zhì)峰14個(gè)(P＜0.05)，其中5，367、5，43

10、2、9，526和9，378 m/z4個(gè)蛋白質(zhì)峰在內(nèi)異組中的表達(dá)低于對(duì)照組，其余10個(gè)蛋白質(zhì)峰在內(nèi)異組呈現(xiàn)高表達(dá)。
　　 4.3個(gè)分泌期線粒體蛋白質(zhì)峰（7，615，5，432和15，868 m/z）組合所構(gòu)建的診斷模型（模型2）鑒別內(nèi)異癥患者的特異度為76.9％，靈敏度為80.0％，與模型1相比，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 5.增殖期內(nèi)異組在位內(nèi)膜/對(duì)照組正常內(nèi)膜組織間共檢測(cè)到線粒體蛋白質(zhì)峰64個(gè)，均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)

11、。
　　 6.2個(gè)增殖期線粒體蛋白質(zhì)峰（3，456 m/z和15，128 m/z）組合所構(gòu)建的診斷模型（模型3）鑒別內(nèi)異患者的特異度為87.5％，靈敏度為85.7％。
　　 7.內(nèi)異組在位內(nèi)膜/對(duì)照組正常內(nèi)膜組織間檢測(cè)到的有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的10個(gè)線粒體差異蛋白質(zhì)峰中，處于Ⅲ、Ⅳ期的內(nèi)異癥患者15，334.15，128、7，573、15，868和7，982m/z五個(gè)蛋白質(zhì)峰值的表達(dá)水平顯著高于臨床分期Ⅰ、Ⅱ的患者(P＜0.05

12、)，5，574和9，378 m/z兩個(gè)峰值在Ⅲ、Ⅳ期的內(nèi)異癥患者的表達(dá)水平顯著低于臨床分期Ⅰ、Ⅱ的患者(P＜0.05）.另外3個(gè)蛋白質(zhì)峰值在不同的臨床分期中表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
　　 第二部分：應(yīng)用SELDI-TOF-MS篩選子宮腺肌病在位內(nèi)膜線粒體差異蛋白的研究
　　 目的：篩選子宮腺肌病在位內(nèi)膜線粒體差異蛋白，建立檢測(cè)模型，并將得到的線粒體差異蛋白與第一部分得到的子宮內(nèi)膜異位癥線粒體差異蛋白進(jìn)行對(duì)比。<

13、br>　　 方法：采用SELDI-TOF-MS技術(shù)檢測(cè)13例子宮腺肌病在位內(nèi)膜和29例對(duì)照患者正常內(nèi)膜組織中線粒體蛋白，并用支持向量機(jī)方法建立判別模型，用留一法評(píng)估模型的預(yù)測(cè)效果。
　　 結(jié)果：1.腺肌病組在位內(nèi)膜/對(duì)照組正常內(nèi)膜組織間共檢測(cè)到線粒體蛋白質(zhì)峰82個(gè)，兩組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異蛋白質(zhì)峰1個(gè)。
　　 2.3個(gè)線粒體蛋白質(zhì)峰（7，614，14，978和6，370 m/z)組合所構(gòu)建的診斷模型鑒別子宮腺肌病患者的

14、特異度為93.1％，靈敏度為84.6％。
　　 3.14個(gè)線粒體蛋白質(zhì)峰同時(shí)出現(xiàn)在內(nèi)異組和腺肌病組，其中3，499m/z的峰在兩組中有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.029)，其余13個(gè)峰值在兩組中的表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)；3，384，3，499，4，237和5，388m/z的蛋白質(zhì)峰在內(nèi)異組和腺肌病組有相反的表達(dá)趨勢(shì)，其余10個(gè)峰值在兩組中有相同的表達(dá)趨勢(shì)。
　　 結(jié)論：
　　 1.子宮內(nèi)膜異位癥和子宮腺肌病患者

15、在位內(nèi)膜與對(duì)照組正常內(nèi)膜相比有差異表達(dá)的線粒體蛋白，在位子宮內(nèi)膜線粒體蛋白的變化可能與內(nèi)異癥和子宮腺肌病的發(fā)生有關(guān)。
　　 2.內(nèi)異癥患者在位內(nèi)膜與對(duì)照組正常內(nèi)膜相比大部分差異表達(dá)的線粒體蛋白質(zhì)峰出現(xiàn)在分泌期，分泌期內(nèi)膜線粒體蛋白可能在內(nèi)異癥形成過(guò)程中較增殖期內(nèi)膜線粒體蛋白發(fā)揮了更大的作用。
　　 3.在內(nèi)異癥中有差異表達(dá)的7個(gè)線粒體蛋白質(zhì)峰與內(nèi)異癥臨床分期有相關(guān)性，提示在位子宮內(nèi)膜線粒體蛋白的變化可能與內(nèi)異癥的發(fā)展、預(yù)

16、后有關(guān)。
　　 4.內(nèi)異癥在位內(nèi)膜線粒體差異蛋白與內(nèi)異癥血清蛋白標(biāo)志物相比，無(wú)吻合的蛋白質(zhì)峰，可能是蛋白質(zhì)從細(xì)胞內(nèi)到血液循環(huán)的過(guò)程中經(jīng)過(guò)了修飾、剪接等過(guò)程，進(jìn)而造成了分子量的改變。
　　 5.內(nèi)異癥在位內(nèi)膜線粒體差異蛋白與內(nèi)異癥在位內(nèi)膜總蛋白標(biāo)志物相比較，有3個(gè)吻合的蛋白質(zhì)峰，對(duì)這些蛋白質(zhì)峰進(jìn)行分離、純化和解碼是下一步的重要工作。
　　 6.組合線粒體蛋白標(biāo)志物（15，334，15，128和16，069 m/z）