不同地理株柔嫩艾美耳球蟲(chóng)雜交蟲(chóng)株F2的培育及體外培養(yǎng)技術(shù)的建立.pdf

1、雞球蟲(chóng)病是危害現(xiàn)代化養(yǎng)雞業(yè)的重大疫病之一。多年來(lái)眾多科學(xué)家對(duì)本病進(jìn)行了大量的研究工作。先后研制出大量抗球蟲(chóng)藥物，并應(yīng)用于臨床實(shí)踐。但由于耐藥蟲(chóng)株的出現(xiàn)及殘留藥物對(duì)人體的危害，使藥物防治受到限制。免疫預(yù)防已成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)，就目前的研究看：球蟲(chóng)的免疫機(jī)制尚未完全闡明，不同種株球蟲(chóng)共有的保護(hù)性抗原尚未得到，已有的疫苗不能對(duì)所有種或同一種不同株的球蟲(chóng)產(chǎn)生完全保護(hù)性免疫。國(guó)外的研究者已利用單卵囊雜交技術(shù)培育雜交蟲(chóng)株，并獲得雜交親本株的遺傳標(biāo)記

2、：如共同抗原等。這方面的報(bào)道在耐藥蟲(chóng)株的研究中較多。本研究將來(lái)自不同地域的野毒株柔嫩艾美耳球蟲(chóng)(甘肅株、北京株、吉林株)，采用單孢子囊接種技術(shù)培育各株單孢子囊后代，利用RAPD技術(shù)進(jìn)行多態(tài)性分析，培育出雜交株F2，且在RAPD中出現(xiàn)了特有條帶，并將F2進(jìn)行體外培養(yǎng)。具體內(nèi)容如下： 雜交親本株的選擇：用五個(gè)不同地理株Eimeria.tenella，即：黑龍江株、山東株、吉林株、北京株、甘肅株，對(duì)10日齡雛雞分別進(jìn)行免疫攻蟲(chóng)，通過(guò)O

3、PG計(jì)數(shù)，糞便計(jì)分，盲腸病變計(jì)分，增重測(cè)定，計(jì)算保護(hù)率，選擇了免疫原性好且具有較強(qiáng)免疫保護(hù)力的甘肅株、北京株、吉林株。 RAPD分析方法的建立：應(yīng)用RAPD(隨機(jī)引物擴(kuò)增多態(tài)性DNA)技術(shù)，對(duì)三個(gè)雜交親本株甘肅株、北京株、吉林株及它們的子代蟲(chóng)株進(jìn)行了分析(14條隨機(jī)引物)。在RAPD分析過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)甘肅株、北京株、吉林株之間存在差異，相似值為0.6022～0.6971，平均為0.6497。各親本株與子代株也存在差異，相似值為0.

4、9838～0.9913，平均值為0.9876。根據(jù)相似值，列出了相似性矩陣，并繪制了親緣關(guān)系樹(shù)狀圖，從而建立了應(yīng)用RAPD技術(shù)鑒定不同地理株柔嫩艾美耳球蟲(chóng)的方法。 雜交蟲(chóng)株的培育：利用雜交技術(shù)對(duì)甘肅株、吉林株、北京株進(jìn)行了雜交，通過(guò)單孢子囊技術(shù)分離雜交后代，并進(jìn)行單孢子囊擴(kuò)增。依據(jù)建立的RAPD分析方法，對(duì)13個(gè)甘肅株與吉林株雜交后代的單孢子囊擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行了分析，在分析中發(fā)現(xiàn)有一個(gè)單孢子囊擴(kuò)增產(chǎn)物的RAPD譜帶與其它不同，且其與

5、兩親本株和子代株的相似性也與其它蟲(chóng)株不同，即：此蟲(chóng)株與兩親本株間的相似值為0.7598～0.8813，遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于子代株與親本株平均相似值0.9876，又遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于株間相似值的平均值0.6497。依據(jù)親緣關(guān)系樹(shù)狀圖，確定該蟲(chóng)株為甘肅株與北京株的雜交蟲(chóng)株(雜交一代，F(xiàn)1)。獲得的雜交F1進(jìn)一步與北京株進(jìn)行雜交(雜交二代，F(xiàn)2)，并用RAPD方法對(duì)13個(gè)雜交后代單孢子囊擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分析，找到了一株與親本株相似性為0.7658～0.8831的蟲(chóng)株，

6、依據(jù)親緣關(guān)系樹(shù)狀圖，確定其為雜交F2株。體外培養(yǎng)的建立：將雜交株F2接種于10-12日齡的雞胚尿囊腔，經(jīng)過(guò)連續(xù)加大劑量和增加接種胚數(shù)的方法，促使球蟲(chóng)逐漸適應(yīng)雞胚，最后直線(xiàn)傳至第9代，球蟲(chóng)已適應(yīng)雞胚，接種劑量由每胚4萬(wàn)條子孢子降至1萬(wàn)條，一直傳至22代，建立起F2株的雞胚適應(yīng)株。 本研究利用雜交技術(shù)，將不同地理株的柔嫩艾美耳球蟲(chóng)混合感染雛雞，雞體內(nèi)配子發(fā)生隨機(jī)交配，將獲得等量的母型和雜交型合子，收集所產(chǎn)生的卵囊，通過(guò)RAPD技術(shù)鑒