細粒棘球蚴中國大陸株鐵蛋白基因的克隆、重組表達、純化及免疫學特性鑒定.pdf

1、目的：擴增中國大陸株細粒棘球蚴(Echinococcus granulosus Eg)鐵蛋白（ferritin）基因，構建重組質(zhì)粒，并對重組蛋白免疫學特性進行鑒定，為包蟲病分子疫苗的研制提供新的候選基因。 方法： (1)以細粒棘球蚴原頭蚴的RNA為模板，根據(jù)互聯(lián)網(wǎng)GenBank檢索出的細粒棘球蚴鐵蛋白基因序列設計引物，采用RT-PCR技術擴增目的基因；(2)將目的基因亞克隆到pGEM-T載體，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌JM109，對重組基

2、因進行DNA測序；(3)利用DNAman、NCBI/BLAST公共數(shù)據(jù)庫對目的基因的同源性進行比較分析。應用DNAstar、Biosun 等生物分析軟件對該鐵蛋白的二級結構、抗原表位、三維結構進行預測；(4)重組表達質(zhì)粒的構建及鑒定Ⅰ：a.將目的基因亞克隆于表達載體pGEX-6P-1，轉(zhuǎn)化入Bl21，誘導融合蛋白(Eg.ferritin/GST)的表達，經(jīng)親和層析法純化Eg.ferritin/GST；b.用含Eg.ferritin/GS

3、T的凝膠條帶免疫小鼠的抗血清及細粒棘球蚴免疫家兔的抗血清，通過Western-blot對Eg.ferritin/GST的免疫學特性進行初步研究；(5)重組表達質(zhì)粒的構建及鑒定Ⅱ：a.將目的基因亞克隆于pET-28a表達載體，轉(zhuǎn)化入BL21(DE3)plysS，誘導表達重組蛋白(Eg.ferritin)，經(jīng)含Ni2+的His-bind樹脂柱純化 Eg.ferritin；b.用Eg.ferritin免疫小鼠的抗血清，通過Western-bl

4、ot及ELISA對Eg.ferritin的免疫學特性進行研究。 結果： (1)PCR得到562bp的目的基因。(2)該基因與互聯(lián)網(wǎng)檢索的基因序列在390bp內(nèi)同源性為97.7％，氨基酸序列在130AA內(nèi)同源性為97.7％。不同生物間的同源性平均達40.79％。生物軟件預測：Eg.ferritin的分子量約16.7 kD，非極性氨基酸數(shù)目為68個，預測抗原表位的肽段為7N-12E,36H -43V, 55S-62H, 69Q-7

5、6R, 82A-89E, 102I-107E, 117A –124S,129L–136T。(3)構建了Eg.ferritin/pGEX-6P-1/BL21基因工程菌株，表達融合蛋白Eg.ferritin/GST，因以包涵體形式存在，無法純化。Western-blot 結果：Eg.ferritin/GST能被Eg免疫家兔的抗血清和Eg.ferritin/GST凝膠條帶免疫小鼠的抗血清識別，同時小鼠抗血清還可識別天然抗原囊液、原頭蚴中約19

6、kD的條帶。(4)構建了Eg.ferritin/pET-28a /BL21(DE3)plysS基因工程菌株，表達并純化出Eg.ferritin。Western-blot檢測：Eg.ferritin免疫小鼠的抗血清可識別Eg.ferritin、天然抗原（囊液及原頭蚴），其位置大致相同約19kD。ELISA結果表明：免疫組血清中的IgG值明顯高于對照組血清(P<0.01)。 結論： (1)成功擴增出中國大陸株細粒棘球蚴鐵蛋白基因，

7、構建了基因工程菌株Eg.ferritin/ pGEM-T/JM109。(2)鐵蛋白結構功能及抗原表位的預測對本實驗的實施及選取有價值的抗原肽段提供了理論依據(jù)。(3)成功構建基因工程菌株Eg.ferritin/pGEX-6P-1/BL21，表達分子量約42kD的融合蛋白Egferritin/GST，但無法純化。(4)成功構建基因工程菌株Eg.ferritin/pET-28a/BL21(DE3) plysS，表達并純化出分子量約19kD的重