肺腺癌耐藥(A549-DDP)與非耐藥(A549)細(xì)胞株蛋白質(zhì)差異比較.pdf

1、背景: 肺癌是目前全球發(fā)病率和死亡率較高的惡性腫瘤之一，作為威脅全世界人類健康的重大疾病，其死亡人數(shù)約占整個(gè)癌癥死亡人數(shù)的17.6％，五年生存率僅為8.9％-15％。且呈逐漸上升趨勢。根據(jù)WHO估計(jì)二十一世紀(jì)我國將成為肺癌發(fā)病率較高的國家之一。肺腺癌作為肺癌發(fā)病的常見類型，化療為治療的重要手段，但是目前對有化療指針的病人化療有效率極低，化療失敗的主要原因是肺腺癌細(xì)胞在化療過程中逐漸產(chǎn)生了耐藥性。以往肺癌的耐藥性研究大多集中在單個(gè)

2、或少數(shù)幾個(gè)相關(guān)基因及其蛋白質(zhì)產(chǎn)物上，難以反映肺癌DNA改變的全貌，因此有必要尋求進(jìn)一步的研究。 目的: 本實(shí)驗(yàn)從蛋白質(zhì)整體入手，利用差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法，找到肺腺癌耐藥細(xì)胞A549/DDP特異表達(dá)耐藥蛋白質(zhì)點(diǎn)，全面、真實(shí)地揭示肺腺癌耐藥的過程和本質(zhì)，為肺腺癌耐藥機(jī)制及其逆轉(zhuǎn)的研究開辟新的思路、提供新的線索，為臨床選藥、評估病人療效以及尋找新的藥物治療靶標(biāo)提供理論據(jù)。 方法: 本研究培養(yǎng)并收集了肺腺癌耐藥

3、細(xì)胞株A549/DDP和非耐藥細(xì)胞株A549細(xì)胞樣品，用雙向凝膠電泳技術(shù)分離兩細(xì)胞樣品中的總蛋白質(zhì)，凝膠經(jīng)改良考馬斯亮藍(lán)染色，用PDQUuest 7.1版本軟件分析、比較二維聚丙烯酰氨凝膠電泳（two-dimensionalpolyacryl-amide gel electrophoresis，2-DPAGE）圖譜，識別差異表達(dá)蛋白質(zhì)點(diǎn)，應(yīng)用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（Matrix-assisted laser desorptio

4、n/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）得到相應(yīng)的肽質(zhì)量指紋圖（peptide mass fingerprint PMF），然后利用生物信息學(xué)方法搜索數(shù)據(jù)庫鑒定確定部分差異蛋白質(zhì)。 結(jié)果: 提取樣品蛋白行二維凝膠電泳，采用考馬斯亮藍(lán)染色后兩組膠每張大約可以檢測到1000個(gè)左右蛋白點(diǎn)，經(jīng)PDQuest軟件分析找到相差2倍以上的差異點(diǎn)約100個(gè)，其

5、中選取差異明顯的40個(gè)差異蛋白點(diǎn)進(jìn)行MOLDI-TOF-MS質(zhì)譜鑒定。質(zhì)譜鑒定獲得35張肽質(zhì)指紋圖，經(jīng)數(shù)據(jù)庫搜索后22個(gè)蛋白點(diǎn)被初步鑒定，其中2個(gè)蛋白點(diǎn)重復(fù)，13個(gè)蛋白點(diǎn)無結(jié)果。用Mascot軟件查詢SwiSS-PROT數(shù)據(jù)庫初步鑒定蛋白質(zhì)點(diǎn)20個(gè)，即熱休克蛋白27（Heat shock protein beta27）、膜聯(lián)蛋白A2 （Annexin A2）、組蛋白（Histone H4）、磷酸丙糖異構(gòu)酶（Triosephos-phat

6、e isomerase）、脂肪酸結(jié)合蛋白（fatty acid binding pro-teins，F(xiàn)ABP）、Peroxinredoxin-4、延伸因子（Elongation factor-1）等。　　 結(jié)論: 1.用固相pH梯度雙向凝膠電泳獲得了重復(fù)性較好的肺腺癌耐藥細(xì)胞株A549/DDP和非耐藥細(xì)胞株A549的雙向電泳凝膠圖譜。 2.肺腺癌耐藥細(xì)胞株A549/DDP和非耐藥細(xì)胞株A549蛋白質(zhì)組表達(dá)存在明顯

7、差異，采用差異表達(dá)蛋白質(zhì)組學(xué)方法，成功鑒定了20種差異表達(dá)的蛋白質(zhì)點(diǎn)，為進(jìn)一步建立人肺腺癌的2-DE數(shù)據(jù)庫奠定了基礎(chǔ)。 3.熱休克蛋白27（Heat shock protein beta27）、膜聯(lián)蛋白A2（Annexin A2）、組蛋白（Histone H4）、磷酸丙糖異構(gòu)酶（Triosephos-phate isomerase）、脂肪酸結(jié)合蛋白（fatty acid binding proteins，F(xiàn)ABP）、Perox