蠟蚧輪枝菌VL17菌株殺蟲毒素純化及其對溫室白粉虱作用機(jī)制初步研究.pdf

1、蠟蚧輪枝菌VL17菌株是沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)藥科學(xué)實(shí)驗(yàn)室篩選出的對溫室白粉虱和蚜蟲具有高致病力的菌株。本試驗(yàn)以VL17菌株為主要研究對象，對其液體發(fā)酵條件、最佳發(fā)酵培養(yǎng)液、毒素粗提物的純化分離及對溫室白粉虱的作用機(jī)制進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，明確了VL17菌株液體發(fā)酵的最適培養(yǎng)基為Czapek，250mL搖瓶發(fā)酵的最佳培養(yǎng)條件為添加酵母浸膏的120mL培養(yǎng)液于28℃200r·min<'-1>下培養(yǎng)5d，分離出了5種活性成分，得到了對溫室白粉虱有較高生

2、物活性的殺蟲毒素，初步研究毒素的作用機(jī)制為觸殺性神經(jīng)毒劑。本試驗(yàn)的研究結(jié)果為將VL17菌株殺蟲毒素開發(fā)成為新型的天然產(chǎn)物農(nóng)藥奠定了理論基礎(chǔ)。 本文采用正交試驗(yàn)方法，利用國產(chǎn)HZQ-F160型全溫振蕩培養(yǎng)箱，在250mL搖瓶中對蠟蚧輪枝菌VL17菌株進(jìn)行液體發(fā)酵條件的優(yōu)化及培養(yǎng)液種類的篩選。結(jié)果顯示：用不同培養(yǎng)液做基質(zhì)時(shí)，各個(gè)發(fā)酵條件因子對VL17菌株發(fā)酵水平的影響能力不同。綜合比較后發(fā)現(xiàn)，在250mL搖瓶中用Czapek恒溫震蕩

3、培養(yǎng)蠟蚧輪枝菌VL17菌株時(shí)，裝入120mL培養(yǎng)液，添加一定量的酵母浸膏(10 g·L<'-1>)，在28℃200r·min<'-1>條件下培養(yǎng)5d即可產(chǎn)生最大量的毒素粗提物。該菌株無論在發(fā)酵性能還是殺蟲毒力上均是一株比較優(yōu)良昆蟲病原真菌，有進(jìn)一步研究應(yīng)用的價(jià)值。因此，本試驗(yàn)將進(jìn)一步對VL17菌株的毒素粗提物作以研究。 在對蠟蚧輪枝菌VL17菌株的毒素粗提物分離和純化的研究中，主要采取了薄層層析與柱層析交叉使用的方法，對毒素粗提

4、物邊分離邊進(jìn)行檢測。研究結(jié)果表明，用石油醚：乙酸乙酯=40：1的比例配制洗脫劑分別對VL17菌株胞外粗提物和胞內(nèi)粗提物進(jìn)行分離純化，獲得了5種胞外毒素成分和1種胞內(nèi)毒素成分，并且胞內(nèi)毒素與胞外毒素的其中一個(gè)成分為同一種產(chǎn)物。對5種組分分別對溫室白粉虱的成蟲和若蟲做生物測定，發(fā)現(xiàn)3號和4號組分對溫室白粉虱成蟲的8h校正死亡率在70％以上，LC<,50>分別為0.29mg·mL<'-1>和0.48 mg·mL<'-1>，而3號組分對溫室白粉

5、虱1齡若蟲的校正死亡率也在70％以上，LC<,50>值為0.16 mg·mL<'-1>。 在對蠟蚧輪枝菌VL17菌株作用機(jī)制的研究中，主要參照了Ellman(1961)和孫耕芹(1987)以及Van Asperene(1962)和鄭炳宗(1988)的方法，測定了殺蟲毒素對溫室白粉虱成蟲和若蟲的離體乙酰膽堿酯酶和羧酸酯酶的影響。結(jié)果顯示，蠟蚧輪枝菌VL17菌株殺蟲毒素對溫室白粉虱成蟲和若蟲的離體乙酰膽堿酯酶活性都有極顯著的抑制作用

6、，毒素處理4h后酶活抑制率分別高達(dá)90.8％和54.0％，毒素對乙酰膽堿酯酶的強(qiáng)烈抑制作用可能是致死溫室白粉虱的主要原因。而VL17菌株殺蟲毒素對溫室白粉虱成蟲和若蟲離體羧酸酯酶的抑制率極低，僅達(dá)到了1.9％和18.0％，基本上沒有表現(xiàn)出抑制作用，對羧酸酯酶的抑制可能不是害蟲致死的原因。本試驗(yàn)分離得到了對溫室白粉虱有較高毒力的蠟蚧輪枝菌VL17菌株殺蟲毒素活性成分。在今后的研究工作中，可以采用紫外光譜法、紅外光譜法、核磁共振法以及質(zhì)譜法