硒蛋白W在雞缺硒性骨骼肌損傷中作用機理研究.pdf

1、硒(Se)是機體必需的微量元素之一，缺硒可導(dǎo)致動物骨骼肌的損傷。大量研究從氧化應(yīng)激、凋亡、炎癥、硒蛋白等不同角度對缺硒性骨骼肌損傷進(jìn)行探討，但其確切機制還不清楚。雖然家畜缺硒性骨骼肌損傷早有報道，但在禽類尚缺乏完整、深入的研究揭示其機制。隨著后基因組時代的到來，大數(shù)據(jù)量的多組學(xué)分析在疾病診斷與研究中被廣泛應(yīng)用，基于其高效性、系統(tǒng)性及深入性等特點，組學(xué)分析大大促進(jìn)研究人員對人類及動物疾病相關(guān)機理的認(rèn)識及研究，因此將轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)等組

2、學(xué)分析應(yīng)用到畜禽疾病的研究上就顯得更加重要。
　　硒蛋白W(Selw)是骨骼肌中不可或缺的硒蛋白之一，扮演著重要角色，其在調(diào)節(jié)骨骼肌生理穩(wěn)態(tài)、硒應(yīng)答以及氧化應(yīng)激等生理病理過程具有重要作用。然而，作為雞骨骼肌中重要的硒蛋白，Selw在缺硒性骨骼肌損傷中的角色及作用還不得知。因此本實驗通過建立雞缺硒性骨骼肌損傷模型，檢測雞骨骼肌中抗氧化酶活性、凋亡水平、硒蛋白表達(dá)、病理學(xué)變化、超微結(jié)構(gòu)變化以及離子水平及分布情況，并利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)

3、組學(xué)及離子組學(xué)分析、篩選并驗證缺硒性骨骼肌損傷中差異表達(dá)基因及參與的信號通路，以揭示雞缺硒性骨骼肌損傷的可能機制及信號通路。同時建立Selw缺失原代培養(yǎng)雞胚成肌細(xì)胞模型，檢測成肌細(xì)胞的抗氧化酶活性、凋亡水平、線粒體膜電位、硒蛋白表達(dá)、超微結(jié)構(gòu)以及鈣離子水平及鈣通道的表達(dá)情況，并利用Realtime PCR方法和Western blot技術(shù)對多組學(xué)所篩選的信號通路進(jìn)行驗證，以探討Selw的生物學(xué)功能及其在雞缺硒性骨骼肌損傷中扮演的角色及作

4、用。進(jìn)一步利用(CRISPR)/CRJSPR-associated9(Cas9)技術(shù)建立Selw敲除雞胚模型，檢測雞胚骨骼肌中抗氧化酶活性、硒蛋白表達(dá)、病理學(xué)變化、超微結(jié)構(gòu)以及鈣離子水平及鈣通道的表達(dá)，并驗證多組學(xué)分析所篩選的相應(yīng)信號通路，以揭示Selw在雞胚骨骼肌中的生物學(xué)功能及其與雞缺硒性骨骼肌損傷的關(guān)系。
　　實驗結(jié)果表明:
　　(1)缺硒雞骨骼肌組織轉(zhuǎn)錄組學(xué)及蛋白質(zhì)組學(xué)共檢測出5個差異的microRNA、725個差異

5、轉(zhuǎn)錄本（mRNA和lncRNA）、450個差異蛋白質(zhì)(P＜0.05)，多組學(xué)分析共篩選并驗證了PI3 K-AKT信號通路、鈣信號通路、JNK-FoxO信號通路、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白加工處理通路、自噬信號通路、糖代謝信號通路、能量代謝信號通路、泛素化通路等信號通路，表明多種信號通路參與到缺硒誘導(dǎo)的骨骼肌損傷過程中。
　　(2)缺硒雞骨骼肌組織離子水平及分布情況的檢測，發(fā)現(xiàn)鈣離子水平呈現(xiàn)降低趨勢，而V，Cr，Mn，Cu，Cd和Hg均有所升高(P

6、＜0.05)，表明Ca，V，Cr，Mn，Cu，Cd和Hg的失衡與缺硒性骨骼肌損傷具有一定的關(guān)系。
　　(3)通過驗證缺硒雞骨骼肌及Selw缺失成肌細(xì)胞和雞胚模型中抗氧化酶活性、ROS水平、超微結(jié)構(gòu)、PI3K-AKT通路、鈣信號通路、FoxO信號通路、凋亡通路、自噬通路、代謝通路、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白加工處理通路、泛素化通路等信號通路并結(jié)合組學(xué)富集分析，證實Selw主要通過激活ROS-JNK-FoxO-Ubi-蛋白酶體/自噬-溶酶體-凋亡/壞

7、死信號通路及抑制ROS-JNK-PI3 K-AKT-mTOR-蛋白合成/能量/糖代謝信號通路導(dǎo)致雞缺硒性骨骼肌損傷的發(fā)生。
　　(4)通過檢測缺硒雞骨骼肌及Selw缺失成肌細(xì)胞和雞胚模型中硒蛋白的表達(dá)變化，證實Selw通過影響Gpx1、Gpx2、Gpx3、Gpx4、Dio1、Dio2、Dio3、Txnrd1、Txnrd3、Selt、Selu、Seln、Sell5、Sels的表達(dá)水平參與到缺硒性骨骼肌損傷過程。
　　(5)通過

8、檢測Selw缺失成肌細(xì)胞和雞胚模型中鈣離子水平，鈣通道的表達(dá)水平及對抑制劑的應(yīng)答情況，發(fā)現(xiàn)Selw通過影響鈣通道SERCA、CACNA1S、TRPC1、TRPC3活性及水平導(dǎo)致成肌細(xì)胞及雞胚鈣流失，并通過調(diào)節(jié)這些鈣通道與缺硒性骨骼肌鈣流失密切關(guān)聯(lián)。結(jié)合多組學(xué)分析、酶學(xué)活性、超微結(jié)構(gòu)等，分析鈣信號與氧化應(yīng)激間的緊密聯(lián)系，揭示鈣信號在誘導(dǎo)Ca/ROS-JNK-FoxO-Ubi-蛋白酶體/自噬-溶酶體-凋亡/壞死信號通路及抑制Ca/ROS-J