腸道派氏結(jié)嗜酸性粒細(xì)胞亞群的發(fā)現(xiàn)及其黏膜免疫調(diào)控功能與機(jī)制的研究.pdf

1、背景和立題依據(jù):由病原微生物感染引起的傳染病是人類(lèi)健康和生命的主要威脅之一。目前發(fā)現(xiàn)，90％以上的人類(lèi)傳染病經(jīng)由黏膜途徑感染。然而，黏膜抗感染免疫機(jī)制至今不明。黏膜抗感染免疫不同于系統(tǒng)免疫，與系統(tǒng)免疫系統(tǒng)相比，黏膜處于一個(gè)長(zhǎng)期帶菌的環(huán)境，接觸不同來(lái)源和性質(zhì)的抗原，這就要求黏膜免疫系統(tǒng)對(duì)有害抗原和無(wú)害抗原具有區(qū)別能力，并反饋為不同的免疫反應(yīng)。對(duì)于食物，正常菌群等無(wú)害抗原，腸道黏膜免疫系統(tǒng)表現(xiàn)為免疫耐受，避免發(fā)生超敏反應(yīng)和自身免疫性疾病，而

2、與無(wú)害抗原相反，腸道內(nèi)的病原體等有害抗原可以被腸道黏膜免疫系統(tǒng)識(shí)別，并引起免疫應(yīng)答。然而，黏膜免疫的機(jī)制至今不明。腸道黏膜免疫系統(tǒng)是機(jī)體免疫系統(tǒng)中最大也是最為復(fù)雜的部分，也最具有代表性。大量研究數(shù)據(jù)揭示，腸道黏膜免疫系統(tǒng)的免疫耐受機(jī)制主要有調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory Tcells，Treg)介導(dǎo)，而誘導(dǎo)性Treg的產(chǎn)生與腸道黏膜微環(huán)境密不可分，這種特殊聯(lián)系來(lái)源于腸道黏膜免疫系統(tǒng)的幾種細(xì)胞或細(xì)胞亞群分泌的維甲酸。上述資料提示，腸道

3、具有分泌維甲酸能力的細(xì)胞或細(xì)胞亞群可能在腸道免疫耐受機(jī)制中發(fā)揮了重要作用。
　　研究?jī)?nèi)容及意義:本文通過(guò)研究腸道派氏結(jié)中不同樹(shù)突狀細(xì)胞亞群維甲酸合成限速酶——醛脫氫酶活性來(lái)篩選誘導(dǎo)腸道免疫耐受的免疫細(xì)胞，研究過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)了一群高表達(dá)醛脫氫酶活性的未知細(xì)胞，鑒定結(jié)果是嗜酸性粒細(xì)胞，并定量檢測(cè)這群腸道嗜酸性粒細(xì)胞維甲酸的分泌量，腸道嗜酸性粒細(xì)胞Treg誘導(dǎo)相關(guān)的細(xì)胞因子——TGF-β和IL-2分泌量，以及腸道嗜酸性粒細(xì)胞與初始型T細(xì)胞

4、共培養(yǎng)后，T細(xì)胞的分化方向。為了檢測(cè)非黏膜來(lái)源的嗜酸性粒細(xì)胞是否具有誘導(dǎo)初始型T細(xì)胞向Treg分化的能力，分離純化外周血嗜酸性粒細(xì)胞，鑒定外周血嗜酸性粒細(xì)胞的表型，外周血嗜酸性粒細(xì)胞的維甲酸分泌量，以及外周血嗜酸性粒細(xì)胞與初始型T細(xì)胞共培養(yǎng)后，Treg的表達(dá)情況。以期待揭示嗜酸性粒細(xì)胞在腸道黏膜免疫中的功能和機(jī)制。
　　研究方法:本文采用美天尼磁珠分選和流式細(xì)胞分選來(lái)收集和純化野生型小鼠腸道黏膜中的樹(shù)突狀細(xì)胞以及腸黏膜和外周血中嗜

5、酸性粒細(xì)胞;流式細(xì)胞儀檢測(cè)醛脫氫酶活性檢測(cè)試劑標(biāo)記的細(xì)胞的醛脫氫酶活性;流式細(xì)胞檢測(cè)細(xì)胞表型鑒定和瑞氏染色形態(tài)學(xué)鑒定高表達(dá)醛脫氫酶活性細(xì)胞的細(xì)胞類(lèi)型;液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用定量檢測(cè)腸道黏膜以及外周血來(lái)源的嗜酸性粒細(xì)胞的維甲酸分泌量;ELISA檢測(cè)腸道黏膜以及外周血來(lái)源的嗜酸性粒細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)上清中TGF-β和IL-2的濃度;純化的腸道黏膜或外周血來(lái)源的嗜酸性粒細(xì)胞與純化的CD4+CD62L+OT-II CD4+初始型T細(xì)胞共培養(yǎng)數(shù)天后，流式細(xì)

6、胞儀檢測(cè)CD4+細(xì)胞中CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞的比例，ELISA檢測(cè)培養(yǎng)上清中IL-4，IL-17，IFN-γ, TGF-β and IL-2的濃度。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果:實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，腸道派氏結(jié)中，存在一群高表達(dá)醛脫氫酶的細(xì)胞，經(jīng)表型和形態(tài)學(xué)鑒定確認(rèn)為嗜酸性粒細(xì)胞，經(jīng)液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用定量檢測(cè)腸道嗜酸性粒細(xì)胞培養(yǎng)上清，發(fā)現(xiàn)這群腸道嗜酸性粒細(xì)胞分泌高濃度維甲酸，采用ELISA檢測(cè)上清，證明這群腸道嗜酸性粒細(xì)胞同時(shí)也分泌TGF-β

7、。將腸道嗜酸性粒細(xì)胞與初始型T細(xì)胞共培養(yǎng)后，流式細(xì)胞檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，6.52％CD4+T細(xì)胞表達(dá)CD25+Foxp3+，說(shuō)明初始型T細(xì)胞向Treg方向分化。為了驗(yàn)證非黏膜來(lái)源的嗜酸性粒細(xì)胞是否具備誘導(dǎo)Treg的功能，分離和純化小鼠外周血嗜酸性粒細(xì)胞，采用流式鑒定細(xì)胞表型，結(jié)果顯示，腸道嗜酸性粒細(xì)胞與外周血嗜酸性粒細(xì)胞表型有差異，腸道嗜酸性粒細(xì)胞表達(dá)CD80和CD11c，而外周血嗜酸性粒細(xì)胞不表達(dá)。同時(shí)，外周血來(lái)源的嗜酸性粒細(xì)胞不能分泌維甲酸。