表皮葡萄球菌和分枝桿菌生物膜相關(guān)基因的鑒定和功能研究.pdf

1、表皮葡萄球菌是醫(yī)源性感染的主要致病菌，大部分發(fā)生在臨床上嚴(yán)重的和免疫力低下的病人身上，同時(shí)與醫(yī)療植入設(shè)備的使用有關(guān)。目前，在中國醫(yī)院環(huán)境中流行的表皮葡萄球菌的克隆分型還不清楚，這些克隆型在醫(yī)院環(huán)境中容易傳播的原因也不清楚。在研究中，我們用MLST分型的方法對從醫(yī)院感染病人身上分離出來的80個(gè)表皮葡萄球菌菌株進(jìn)行克隆分型。它們被分成16個(gè)不同的克隆型，其中，最流行的ST2包含了所有ica陽性，IS256陽性，生物膜陽性的菌株。而且發(fā)現(xiàn)在醫(yī)

2、院環(huán)境流行的菌株，高達(dá)96.25％的都是耐甲氧西林的。80株菌株中共發(fā)現(xiàn)有4種SCCmec分型，但是沒有一株攜帶有SCCmecⅠ型。所有的ST2型菌株都攜帶SCCmecⅢ型。綜上所述，生物膜形成能力和耐藥能力的聯(lián)合使得ST2型能夠成功的在醫(yī)院環(huán)境中傳播，引起插管感染和菌血癥。這與生物膜形成能力被公認(rèn)為是表皮葡萄球菌致病的主要機(jī)制相符。(第一部分)
　　 生物膜是細(xì)菌黏附于有機(jī)或無機(jī)材料表面，合成分泌細(xì)胞外基質(zhì)包被細(xì)菌所形成的細(xì)菌

3、群體結(jié)構(gòu)。生物膜的形成是細(xì)菌逃逸宿主免疫清除的主要機(jī)制，也是細(xì)菌體內(nèi)播散感染的病灶。因此，對于表皮葡萄球菌生物膜形成分子機(jī)制的深入研究，將有助于提供防治表皮葡萄球菌感染的有效措施。在研究中，我們利用轉(zhuǎn)座子對臨床分離的生物膜陽性表皮葡萄球菌1457構(gòu)建了隨機(jī)插入突變庫，通過生物膜半定量的方法篩查了大約1000個(gè)菌株，發(fā)現(xiàn)12個(gè)菌株的生物膜形成明顯缺陷。這12個(gè)菌株插入到11個(gè)不同的基因中，其中有2個(gè)基因(ica，aap)是已經(jīng)報(bào)道過的與生

4、物膜相關(guān)的基因，其他9個(gè)都是新發(fā)現(xiàn)的與生物膜相關(guān)的基因，包括SERP0541，SERP0142，SERP1657，SERP0270，SERP2282等。我們選擇了SERP0541(ygs)基因進(jìn)行下一步研究。首先，比較野生株和突變株我們發(fā)現(xiàn)突變株的生物膜形成明顯缺陷且在生物膜形成的第二階段PIA的合成量也明顯減少，通過構(gòu)建質(zhì)?；パa(bǔ)回突變株發(fā)現(xiàn)突變株的生物膜形成能力能回復(fù)到野生株的水平，說明ygs是一個(gè)影響生物膜形成的新的基因。既然基因y

5、gs影響生物膜形成是通過PIA，為了進(jìn)一步研究是否由編碼PIA的icaADBC表達(dá)水平的改變引起的，我們通過定量PCR的方法檢測了ica的表達(dá)水平，在對數(shù)期我們發(fā)現(xiàn)野生株中icaB的表達(dá)水平是突變株的9倍，而icaR在突變株的表達(dá)水平是野生株的2-3倍，這說明ygs在轉(zhuǎn)錄水平通過影響icaR來調(diào)節(jié)icaADBC的。另外，在各種壓力下，包括熱，高pH，高鹽，乙醇等條件都可以使ygs突變株的生長明顯比野生株要慢，這些都說明ygs基因參與了多

6、種應(yīng)激條件的反應(yīng)，且通過控制PIA的產(chǎn)量來影響生物膜的形成。而且，ygs基因在大鼠中央靜脈插管感染模型和小鼠皮下置管感染模型的致病性方面都發(fā)揮著重要的致病作用。因此，我們得出的結(jié)論是ygs基因影響了生物膜的集聚和壓力的抵抗，在生物膜相關(guān)感染中對生物膜的結(jié)構(gòu)和生理發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。(第二部分)
　　 分枝桿菌也有形成生物膜的能力，目前已經(jīng)有報(bào)道結(jié)核分枝桿菌的生物膜中含有高耐藥性的結(jié)核菌。結(jié)核病現(xiàn)在仍然是致死率僅次于艾滋病的全球

7、第二大感染性疾病，而耐藥性是當(dāng)前結(jié)核病控制的難點(diǎn)。因此，對結(jié)核生物膜分子機(jī)制的研究變得更加重要。恥垢分枝桿菌和海分枝桿菌是近年來發(fā)展起來的研究結(jié)核分枝桿菌致病性的模式生物。為了篩選出分枝桿菌生物膜相關(guān)的新的基因，我們對分枝桿菌的轉(zhuǎn)座子突變庫進(jìn)行篩選，得到幾株生物膜表型發(fā)生改變的菌株，其中一株插入到aceE基因。我們進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)aceE突變株菌落形態(tài)也發(fā)生改變，遷移能力下降，對酸的耐受性降低。這些表型在互補(bǔ)株中都能回復(fù)到野生型水平。細(xì)菌

8、生物學(xué)表型的改變通常與細(xì)胞壁的脂質(zhì)成分改變有關(guān)，2D-TLC分析突變株的細(xì)胞壁脂質(zhì)成分發(fā)現(xiàn)TAGs和另一種脂質(zhì)MDAGs都減少，互補(bǔ)株中TAGs能回復(fù)到野生型的水平，說明TAGs與菌落形態(tài)，生物膜等表型的改變有關(guān)。我們還發(fā)現(xiàn)在以葡萄糖和甘油作為碳源的7H9培養(yǎng)基中，突變株生長比野生株慢，但是在以乙酸鹽作為碳源的培養(yǎng)基中它們的生長沒有差異，說明aceE基因參與了糖和甘油作為碳源的吸收。(第三部分)
　　 通過海分枝桿菌轉(zhuǎn)座子突變庫

9、的篩選，有趣的是，發(fā)現(xiàn)三株突變株的轉(zhuǎn)座子插入到同一基因中，這一基因?yàn)楹７种U菌的mmaA4基因，參與分枝菌酸的合成。結(jié)核分枝桿菌有三類分枝菌酸，α-分枝菌酸，酮(keto)-分枝菌酸和甲氧基(methoxy)-分枝菌酸。mmaA4基因突變會(huì)導(dǎo)致后兩種分枝菌酸生成缺陷。分枝菌酸和海藻糖組成的α，α’-海藻糖二分枝菌酸酯(TDM)，也稱作索狀因子，長久以來被認(rèn)為是致病性分枝桿菌的典型結(jié)構(gòu)。海分枝桿菌mmaA4基因突變后，突變株菌落形態(tài)發(fā)生改

10、變，索狀結(jié)構(gòu)消失，遷移能力降低，不能形成生物膜。這些生物學(xué)表型在互補(bǔ)株中都完全回復(fù)。分枝菌酸與生物膜相關(guān)已經(jīng)有過報(bào)道，為了研究哪種分枝菌酸在生物膜的形成中更加重要，我們用另一株mmaA3突變株來研究，mmaA3基因突變后甲氧基.分枝菌酸生成缺陷，在突變株中過表達(dá)mmaA3基因后導(dǎo)致甲氧基.分枝菌酸生成過多，酮-分枝菌酸缺失。在生物膜試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)野生株和mmaA3突變株形成生物膜是同步的，而互補(bǔ)株中生物膜形成時(shí)間延遲，說明酮-分枝菌酸在生物