5-氨基酮戊酸光動力(ALA-PDT)對表皮葡萄球菌浮游菌和生物膜抗菌效應研究.pdf

1、表皮葡萄球菌(S.epidermidis)是人體皮膚和粘膜上定居的正常菌群之一,通常情況下致病力較弱。隨著各種有創(chuàng)性治療方法的開展及人口老齡化、免疫力低下人群的出現(xiàn)等,凝固酶陰性的葡萄球菌尤其是表皮葡萄球菌引起的院內感染發(fā)生率呈逐年增高趨勢,甚至已經(jīng)超過金黃色葡萄球菌,成為院內感染的重要致病菌之一。據(jù)報道,在皮膚及軟組織感染、燒傷創(chuàng)面、潰瘍及濕疹皮炎等部位極易引起表皮葡萄球菌感染,表皮葡萄球菌之所以成為目前關注的重點,是因為表皮葡萄球菌

2、可以粘附于物體或病灶表面形成生物膜(Bacterial biofilm,BBF)而致病。BBF可以保護內部細菌逃避抗菌藥物及宿主免疫殺傷,而且生物膜持續(xù)釋放細菌進入血流引起感染的慢性及反復發(fā)作,臨床常規(guī)抗感染治療難以湊效。
　　光動力療法( photodynamic therapy, PDT)是一種新型的非侵入性治療手段,通過光敏劑選擇性聚集于靶細胞,在相應波長光源照射下,組織細胞產(chǎn)生單線態(tài)氧和自由基等細胞毒性物質從而對靶細胞產(chǎn)生

3、選擇性殺傷作用。20世紀90年代以前,PDT的研究主要集中于腫瘤的診斷和治療,在近20年的皮膚科臨床研究與應用中,該技術愈加成熟與完善。近年來,隨著新型光敏劑的出現(xiàn)和應用,以及治療技術的改進,在非腫瘤性疾病特別是細菌性疾病和病毒性疾病的治療上PDT也取得了顯著的療效。國外已有學者采用不同的光敏劑進行PDT抗菌研究,并取得了良好的抑菌效果,但尚未見ALA-PDT對表皮葡萄球菌浮游菌及生物膜相關抗菌研究。由于實驗條件、光敏劑及光源的不同,所

4、報道的PDT治療參數(shù)差別較大。本課題從ALA在細菌體內的熒光藥代動力學開始,研究表皮葡萄球菌對ALA的吸收和轉化為原卟啉IX(Protopophrin IX,PpIX)的情況,尋找PpIX的峰值時間,確定最佳照光時間點;進一步探討ALA-PDT對表皮葡萄球菌浮游菌及生物膜的抗菌效應,尋找最佳光敏劑濃度和光照劑量。
　　目的：
　　1、研究ALA在細菌體內轉化為PpIX的熒光藥代動力學,確定最佳敷藥時間。2、探討不同藥物濃度和

5、不同光照劑量的ALA-PDT對表皮葡萄球菌浮游菌抗菌效應,建立有關ALA-PDT治療細菌感染的最佳參數(shù),如: ALA藥物濃度及照光劑量。
　　3、建立細菌生物膜研究模型,為進一步研究ALA-PDT對細菌生物膜抗菌效應提供研究模型。
　　4、探討ALA-PDT對細菌生物膜的抗菌效應,建立ALA-PDT治療細菌生物膜感染的最佳參數(shù),如:ALA藥物濃度及照光劑量。
　　方法：
　　1、明確PpIX熒光強度與敷藥時間和藥

6、物濃度的關系。
　　實驗分為三組:第一組采用50mM ALA與表皮葡萄球菌37℃,避光共孵育3、5、8、12、16、18、20、24h后,CLSM檢測不同時間點的PpIX熒光強度,明確相同濃度的 ALA在細菌體內轉化為 PpIX的熒光強度是否和孵育時間有關;第二組采用不同濃度 ALA(10、20、30、40、50mM)與細菌37℃,避光共孵育16h后,CLSM檢測PpIX熒光強度,明確不同濃度ALA孵育相同時間后,在細菌體內轉化為

7、 PpIX的熒光強度是否與藥物濃度有關;第三組為陰性對照組(不加ALA),避光共孵育24h后,CLSM檢測PpIX熒光強度,明確表皮葡萄球菌是否含有內源性PpIX。
　　2、確定ALA-PDT對表皮葡萄球菌浮游菌抗菌效應相關參數(shù)(光照劑量和藥物濃度)。
　　實驗分為三組:第一組采用50mM ALA與表皮葡萄球菌37℃,避光共孵育16h后給予不同劑量(30、50、70、90、100J/cm2)的紅光照射;第二組采用不同濃度 A

8、LA(10、20、30、40、50mM)與細菌37℃,避光共孵育16h后,給予100J/cm2的紅光照射;第三組為陰性對照組,采用單純 TSB培養(yǎng)基(不加ALA)培養(yǎng)細菌16h,不進行光照處理。三組標本均通過菌落計數(shù)法分析 ALA-PDT對表皮葡萄球菌浮游菌的抗菌效應,明確 ALA-PDT對表皮葡萄球菌浮游菌抗菌作用的最佳藥物濃度和照光劑量。
　　3、建立細菌生物膜研究模型。
　　采用24孔細胞培養(yǎng)板,蓋玻片上形成生物膜,熒

9、光技術標記細菌,結合 CLSM觀察生物膜的形成情況,為進一步研究 ALA-PDT對細菌生物膜的抗菌效應提供研究模型。
　　4、探討ALA-PDT對細菌生物膜的抗菌效應。
　　實驗分為治療組和對照組,治療組生物膜制備的同時加入 ALA孵育,培養(yǎng)16h后給予不同劑量(100-300J/cm2)的紅光照射。對照組不加 ALA,培養(yǎng)16h,不進行光照處理。兩組分別通過菌落計數(shù)法分析 ALA-PDT對細菌生物膜抗菌作用;CLSM檢測

10、ALA-PDT對細菌生物膜活力的影響;SEM檢測 ALA-PDT對細菌生物膜形態(tài)結構的影響。
　　結果：
　　1、PpIX熒光強度與敷藥時間和藥物濃度的關系
　　第一組,50mMALA與細菌37℃,避光共孵育3、5、8、12、16、18、20、24h后,CLSM下均觀察到 PpIX磚紅色熒光,熒光強度隨著孵育時間的延長而逐漸增強,孵育16、18、20、24h的熒光強度明顯高于3、5、8、12h(p﹤0.05);第二組,

11、10、20、30、40、50mM的ALA與細菌37℃,避光共孵育16h后,CLSM下均觀察到 PpIX磚紅色熒光,PpIX熒光強度隨著 ALA濃度的增加而增強,50mM濃度組PpIX熒光強度明顯高于10、20、30、40mM濃度組(p﹤0.05);第三組,單純TSB培養(yǎng)基不加ALA與細菌37℃,避光共孵育24h后,未見PpIX磚紅色熒光。
　　2、不同光照劑量和藥物濃度的ALA-PDT對表皮葡萄球菌浮游菌抗菌作用
　　第一組

12、,隨著光照劑量的增加(30、50、70、90、100J/cm2),存活的細菌數(shù)逐漸減少,當光照劑量達到100J/cm2時,無菌落生長。各劑量組療效與對照組比較,差異有統(tǒng)計學意義(p﹤0.01),各劑量組療效兩兩比較,差異有統(tǒng)計學意義(p﹤0.01)。第二組:隨著 ALA濃度的增加(10、20、30、40、50mM),存活的細菌數(shù)量逐漸減少,50mM ALA組無菌落生長。各濃度組療效與對照組比較,差異有統(tǒng)計學意義(p﹤0.01),各濃度組

13、療效兩兩比較,差異有統(tǒng)計學意義(p﹤0.01)。
　　3、生物膜制備結果
　　表皮葡萄球菌(ATCC35984)培養(yǎng)16h后形成且肉眼可見灰白色、膜狀物,平鋪在蓋玻片上,經(jīng)熒光染色后,在 CLSM下觀察,可見該膜狀物呈現(xiàn)綠色熒光,并有一定的厚度,膜內細菌形成致密結構,并有許多細胞聚集成團,細胞周圍有許多基質,并被網(wǎng)狀管道所分隔?？v切面和橫切面上可以觀察到膜表面有少量的浮游菌將掃描表皮葡萄球菌生物膜后得到的數(shù)據(jù),用專業(yè)軟件進行

14、處理,得到了表皮葡萄球菌生物膜的三維立體圖像,可形象的觀察到生物膜中細菌聚集成一團,像一個個小山包,組成了石林一樣的圖像,有些團塊中空,像有管道穿入其內。這更形象地說明了生物膜具有三維立體的結構,且形態(tài)具有多樣、不均質、開放的特點,這和以前的研究報道相似,為我們進一步研究 ALA-PDT對表皮葡萄球菌生物膜抗菌效應提供了研究模型。
　　4、ALA-PDT對生物膜細菌的抗菌效應
　　治療組經(jīng)不同劑量的紅光照射后,菌落計數(shù)法觀察

15、到存活的細菌數(shù)呈逐漸減少趨勢,經(jīng)統(tǒng)計學處理,各光照劑量組與對照組之間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01),各劑量組兩兩相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01);CLSM下觀察到生物膜細菌活力逐漸降低,死菌/活菌比例逐漸增高,各劑量組與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01),各劑量組兩兩相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01);SEM觀察到生物膜結構疏松,隨著光照劑量的增加,生物膜結構逐漸模糊,當光照劑量達300J/cm2時,生物膜結構消失,多數(shù)

16、細菌呈單菌落分布。
　　結論：
　　1、表皮葡萄球菌能很好的吸收ALA并在菌體內轉化為PpIX,PpIX在CLSM下呈現(xiàn)磚紅色熒光,且熒光強度隨著孵育時間和 ALA濃度的增加而逐漸增強,表皮葡萄球菌本身不含內源性的PpIX。
　　2、ALA-PDT對表皮葡萄球菌浮游菌有明顯的生長抑制作用,當達到最適治療參數(shù)即50mM ALA,孵育16h、100 J/cm2的光劑量,可以滅活浮游表皮葡萄球菌。3、成功制備了表皮葡萄球菌(