卡介菌多糖核酸對表皮葡萄球菌、金黃色葡萄球菌及白假絲酵母菌增殖的影響.pdf

1、目的:皮膚作為機體抵御感染的第一道防線，是人體重要的免疫器官。它表面定植著大量的微生物，以細菌為主還包括真菌、病毒、衣原體和某些原蟲，構(gòu)成了一個生態(tài)系統(tǒng)，即“微生態(tài)”。它們在生理功能上相互作用，從而使這些微生物可以在上皮定植、共生。大部分微生物是對人體無害的，有些甚至是有益的。它們同時也受到人體固有免疫和獲得性免疫的影響，與人體免疫系統(tǒng)共同進化。伴隨著分子生物學的發(fā)展，皮膚上復雜與龐大的常駐菌群被逐漸認知。對皮膚微生物的深入了解不僅可以

2、幫助人們了解微生物與皮膚屏障的相互作用機制，也可為微生物引起的皮膚疾病的治療提供有效的策略。
　　表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis，S.epidermidis)是一種凝固酶陰性的共生菌，在皮膚和粘膜上廣泛存在，屬正常菌群類型。有研究表明表皮葡萄球菌可以選擇性的抑制病原菌，如金黃色葡萄球菌和乙型溶血性鏈球菌的生長。還有研究表明表皮葡萄球菌還有抑制痤瘡丙酸桿菌，抵抗利什曼蟲作用。但是近年來表皮葡萄球菌

3、引起的院內(nèi)感染發(fā)生率逐年上升，其原因是表皮葡萄球菌可以粘附于物體或病灶表面形成生物膜(Bacterial biofilm，BBF)而致病。現(xiàn)代醫(yī)學材料和許多慢性細菌感染性疾病的器官組織表面均發(fā)現(xiàn)BBF的存在。臨床常規(guī)抗生素抗感染治療難以湊效，給臨床治療帶來了巨大的負擔。
　　金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，S.aureus)是一種條件致病菌，引起許多嚴重感染。是一種不利于人體的細菌，金黃色葡萄球菌對一些

4、皮膚疾病的發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色。
　　白假絲酵母菌(Canidia albicans，C.albicans)是人類常見的條件致病真菌，其感染常見于免疫缺陷的病人，比如艾滋病、惡性腫瘤、器官移植患者，并與臨床廣泛使用免疫抑制劑，廣譜抗生素有關(guān)，是念珠菌感染最常見的菌種。細菌與白假絲酵母菌共同形成的生物膜對疾病的影響也是當前研究的熱點。
　　卡介菌多糖核酸(BCG Polysaccharide nucleic acid，BCG

5、-PSN)是我國首創(chuàng)的新型治療和免疫調(diào)節(jié)劑，從卡介苗中提取的菌體成分，主要由卡介菌多糖、卡介菌核酸組成。BCG-PSN通過刺激網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)、致敏T淋巴系統(tǒng)，進而分泌和釋放一系列細胞因子（如IL-2、IFN-γ等）。BCG-PSN還能促進單核巨噬細胞的吞噬功能，增強NK細胞的殺傷力等，增強抗感染、抗過敏作用。傳統(tǒng)的使用方法為肌肉注射，其是否可以直接作用于皮膚表面的菌群，目前未見報道。
　　本實驗依據(jù)本課題組前期的實驗經(jīng)驗，探索BCG

6、-PSN對皮膚上的一些微生物增殖的影響，探討B(tài)CG-PSN這種“舊藥”對皮膚菌群調(diào)節(jié)方面的“新用”。
　　研究方法:1、試驗對象:表皮葡萄球菌(ATCC(@)12228TM)標準菌株;金黃色葡萄球菌(ATCC(@)65)標準菌株;白假絲酵母菌(ATCC(@)11006)標準菌株;表皮葡萄球菌(ATCC(@)35984TM)標準菌株。
　　2、酶標儀法分析卡介菌多糖核酸對表皮葡萄球菌(ATCC(@)12228rM)標準菌株、表

7、皮葡萄球菌(ATCC(@)35984TM)標準菌株、金黃色葡萄球菌(ATCC(@)65)標準菌株、白假絲酵母菌(ATCC(@)11006)標準菌株增殖的影響方案。將卡介菌多糖核酸凍干粉稀釋成一定的濃度，加入到這4種微生物菌懸液中，于96孔板（U型底）中培養(yǎng)，加板蓋放入酶標儀中，600nm波長、每隔1小時、連續(xù)25小時檢測吸光度(opticaldensity，OD值)的變化。
　　3、半定量粘附試驗和激光共聚焦顯微鏡觀察法分析卡介菌

8、多糖核酸對表皮葡萄球菌生物膜形成的研究。3.1半定量粘附試驗分析卡介菌多糖核酸對表皮葡萄球菌生物膜形成的影響:將卡介菌多糖核酸凍干粉稀釋(濃度梯度為0.35mg/ml、0.70mg/ml、1.40mg/ml、2.80mg/ml、5.60mg/ml)加入能形成生物膜的表皮葡萄球菌(ATCC(@)35984TM)懸液中（濃度為1.5×106CFU/ml），在4個96孔板（平底）中培養(yǎng)，分別在2、4、6、24小時，倒掉菌液用PBS洗3遍后加結(jié)

9、晶紫染色，30分鐘后再洗3遍后，不加板蓋放入酶標儀中，570nm波長，檢測吸光度（optical density，OD值）的變化。3.2激光共聚焦顯微鏡觀察卡介菌多糖核酸對生物膜活力的影響:將卡介菌多糖核酸凍干粉稀釋(濃度梯度為0.35mg/ml、0.70mg/ml、1.40mg/ml、2.80mg/ml、5.60mg/ml)加入能形成生物膜的表皮葡萄球菌(ATCC(@)35984TM)懸液中（濃度為1.5×106CFU/ml），于底部

10、放有圓形細胞爬片的12孔板（平底）中培養(yǎng)，24小時后用Live/Dead(@)BaclightTM Bacterial Viability Kit進行熒光染色，15分鐘后使用激光共聚焦顯微鏡觀察生物膜形成情況。
　　4、統(tǒng)計分析:所得數(shù)據(jù)使用EXCEL制作圖表、SPSS軟件進行數(shù)據(jù)分析，統(tǒng)計學方法組間采用單因素方差分析，各組間采用非配對T檢驗，比較實驗組與對照組的差異，P值＜0.05認為有統(tǒng)計學差異。
　　結(jié)果:1、卡介菌多

11、糖核酸濃度為0.17mg/ml時為促進表皮葡萄球菌增殖的最低有效濃度，其對不能形成生物膜的表皮葡萄球菌(ATCC(@)12228rM)標準菌株及能形成生物膜的表皮葡萄球菌(ATCC(@)35984TM)菌株的增殖均具有促進作用。2、隨著卡介菌多糖核濃度的提高，其抑制表皮葡萄球菌生物膜形成的能力逐漸增強。3、對金黃色葡萄球菌、白假絲酵母菌增殖無明顯影響。
　　結(jié)論:1、卡介菌多糖核酸對能形成生物膜及不能形成生物膜的表皮葡萄球菌增殖均