MARCCT-1在腎透明細(xì)胞癌中的表達(dá)以及對(duì)人腎癌細(xì)胞株A498生物學(xué)特性影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景和目的:
　　 腎癌(renal cell carcinoma，RCC)是泌尿外科最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率高，僅次于膀胱癌，占成人所有惡性腫瘤的2％-～3％，其病理分型以腎透明細(xì)胞癌(clearrenal cellcarcinoma，ccRCC)多見，占70％～80％左右。腎癌的發(fā)病率和死亡率在過去的50年中持續(xù)上升。腎癌侵襲轉(zhuǎn)移能力較強(qiáng)，術(shù)后復(fù)發(fā)率高，轉(zhuǎn)移性腎癌預(yù)后差，因此，研究RCC侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)制，篩選出反映R

2、CC侵襲轉(zhuǎn)移及預(yù)后的腫瘤標(biāo)志物，對(duì)于RCC患者的治療和預(yù)后評(píng)估均具有重大意義。目前已經(jīng)有多個(gè)研究證實(shí)lncRNA與腫瘤的發(fā)病、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)密切相關(guān)，并找到了部分腫瘤特異性lncRNAs，因此，我們推測(cè)在腎癌侵襲轉(zhuǎn)移過程中很可能存在相關(guān)的lncRNAs，而lncRNAs在腎透明細(xì)胞癌中的作用即是本文研究中的重點(diǎn)。
　　 實(shí)驗(yàn)方法:
　　 1.采用lncRNAs芯片技術(shù)，將腎癌患者根據(jù)臨床分期分為兩組:轉(zhuǎn)移組(T3M1N0)組

3、和非轉(zhuǎn)移組(T1aM0N0)，分別取腎癌原發(fā)灶腫瘤組織，篩選差異表達(dá)的lncRNAs;
　　 2采用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)在腎透明細(xì)胞癌腫瘤組織以及癌旁非腫瘤組織中MARCCT-1的表達(dá)情況，研究其與臨床分級(jí)、病理分級(jí)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系。
　　 3.采用RNAi特異性抑制A498細(xì)胞中MARCCT-1的表達(dá)后，以CCK8法、AnnexinV/PI雙染法、Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)分別觀察細(xì)胞增殖、凋亡及侵襲遷移

4、能力的變化。
　　 結(jié)果:
　　 1.篩選出320個(gè)與腎透明細(xì)胞癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)的差異表達(dá)lncRNA，其中114個(gè)lncRNA在出現(xiàn)腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移時(shí)表達(dá)上調(diào)，206個(gè)lncRNA在腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移時(shí)表達(dá)下調(diào)。
　　 2.采用RT-PCR方法檢測(cè)腫瘤與配對(duì)癌旁非腫瘤組織，腫瘤組織中的MARCCT-1表達(dá)在78.6％（11例）的樣本中上調(diào)，在21.4％（3例）例樣本中下調(diào)，其中ccRCC中MARCCT-1的相對(duì)表達(dá)量為3.

5、52×10-2±5.20×10-2，癌旁非腫瘤組織中的相對(duì)表達(dá)量為0.106±0.165，發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中MARCCT-1表達(dá)水平較高。根據(jù)病理分級(jí)進(jìn)行分組，高分化組MARCCT-1在癌組織中相對(duì)癌旁組織的表達(dá)倍數(shù)為7.66±12.19，中-低分化組為10.29±11.98，沒有顯著差異。在不同臨床分期樣本中，Ⅰ期MARCCT-1在癌組織中相對(duì)癌旁組織的表達(dá)倍數(shù)為10.53±14.19，Ⅱ～Ⅳ期為7.41±9.45，沒有顯著差異，提示其表

6、達(dá)水平可能與臨床分期和病理分級(jí)無明顯關(guān)系。根據(jù)有無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移分組樣本中，無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組MARCCT-1在癌組織中相對(duì)癌旁組織的表達(dá)倍數(shù)為5.50±9.94，有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組為21.70±9.24，發(fā)現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組中MARCCT-1表達(dá)水平較高。
　　 3.采用CCK-8法觀察用MARCCT-1 siRNA特異性下調(diào)A498細(xì)胞中MARCCT-1表達(dá)后，結(jié)果顯示在48、72、96小時(shí)后，對(duì)A498細(xì)胞增殖的抑制率分別為16.95％、18.7

7、7％、17.73％，發(fā)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞增殖具有明顯抑制作用。
　　 4.采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)用MARCCT-1 siRNA特異性下調(diào)A498細(xì)胞中MARCCT-1表達(dá)后，發(fā)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞凋亡無明顯作用。
　　 5.采用Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)用MARCCT-1 siRNA特異性下調(diào)A498細(xì)胞中MARCCT-1表達(dá)后，結(jié)果顯示侵襲細(xì)胞數(shù)對(duì)照組704.3±82.4，轉(zhuǎn)染組361.7±12.6，發(fā)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞侵襲具有明顯抑制作用。

8、　　 6.采用劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)用MARCCT-1 siRNA特異性下調(diào)A498細(xì)胞中MARCCT-1表達(dá)后，發(fā)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞遷移具有明顯抑制作用。
　　 結(jié)論:
　　 1、發(fā)現(xiàn)了300多個(gè)可能與腎透明細(xì)胞癌癌侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)的候選lncRNAs。
　　 2、腎透明細(xì)胞癌患者癌組織中的MARCCT-1的表達(dá)水平較癌旁非腫瘤組織明顯上調(diào)，提示MARCCT-1表達(dá)的上調(diào)可能與腎透明細(xì)胞癌的發(fā)病機(jī)制相關(guān)。
　　 3、在腎透明

9、細(xì)胞癌患者中，有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者癌組織相對(duì)癌旁組織的MARCCT-1表達(dá)水平較無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組高，提示MARCCT-1的表達(dá)上調(diào)可能與ccRCC的腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)，MARCCT-1的表達(dá)水平與ccRCC的病理分級(jí)及臨床分期組合無顯著相關(guān)性。
　　 4、MARCCT-1 siRAN能有效的轉(zhuǎn)染于A498細(xì)胞，降低A498細(xì)胞中MARCCT-1的表達(dá)。
　　 5、降低MARCCT-1的表達(dá)能使A498細(xì)胞增殖能力受到抑制，同時(shí)細(xì)胞的