MicroRNA-155在腎透明細(xì)胞癌中的表達(dá)以及對人腎癌細(xì)胞ACHN生物學(xué)性狀的影響.pdf

1、研究背景：腎癌(renal cell carcinoma，RCC)是常見的泌尿系惡性腫瘤，發(fā)病率僅次于膀胱癌，位居第二，其發(fā)病率占成人惡性腫瘤的2％～3％，其中腎透明細(xì)胞癌(clear renal cell carcinoma，ccRCC)占70％～80％左右。全世界腎癌發(fā)病率每年增加2％，每年死于腎癌者近100000例。腎癌早期無癥狀，約50％的患者首次就診時(shí)已經(jīng)屬于晚期，進(jìn)展期腎癌的5年生存率低于10％。在我國，近年來腎癌的發(fā)病率有

2、上升的趨勢，嚴(yán)重威脅者人民的生命健康安全，但是我們對腎癌的發(fā)病機(jī)制尚缺乏全面和深入的了解。和其他的腫瘤相比，腎癌惡性程度高，傳統(tǒng)的治療方法除外科手術(shù)外，化療、放療、免疫治療等并不能起到良好的治療效果。因此闡明發(fā)病機(jī)理、尋找新的治療手段仍然是泌尿外科的熱點(diǎn)課題。
　　 微小RNA(microRNA或miRNA)是一類近年來發(fā)現(xiàn)的長度為21～25個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼小RNA分子，miRNA可通過與靶mRNA的3’非編碼區(qū)結(jié)合，可以

3、在轉(zhuǎn)錄后水平通過促進(jìn)靶mRNA降解和/或抑制其翻譯而發(fā)揮負(fù)調(diào)控基因表達(dá)的作用。miRNAs廣泛地參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化、凋亡，以及個(gè)體發(fā)育、機(jī)體代謝等過程。研究發(fā)現(xiàn)，miRNAs在不同的腫瘤組織中表達(dá)水平不同，有些表達(dá)水平明顯低于正常組織，有些則明顯的上調(diào)，這些表達(dá)異常的miRNAs可能與腫瘤的發(fā)生有著密切的關(guān)系，并在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著癌基因或抑癌基因的作用。目前認(rèn)為，引起miRNA在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)水平發(fā)生改變的可能原因有染色體重組

4、、基因擴(kuò)增、突變及表觀遺傳學(xué)改變等。
　　 miR-155，定位于人染色體21q21，由BIC基因編碼。人類BIC基因含3個(gè)外顯子，其中第3個(gè)外顯子高度保守的區(qū)域編碼miR-155。miR-155是一個(gè)典型的多功能基因，由其下游基因介導(dǎo)，參與多種生理病理過程，如腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，炎癥和免疫，其在人類多種惡性腫瘤中高表達(dá)，如非小細(xì)胞肺癌，乳腺癌，胰腺癌等。研究表明在很多腫瘤中miR-155作為癌基因發(fā)揮功能。
　　 盡管m

5、iR-155功能和表達(dá)的調(diào)節(jié)機(jī)制仍然不甚清楚，但是在多種腫瘤組織中的過表達(dá)讓我們意識(shí)到其在腫瘤診斷和治療中的巨大潛力。為了探索miR-155與腎透明細(xì)胞癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系，我們用實(shí)時(shí)實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測其在腎透明細(xì)胞癌及癌旁非腫瘤組織中的表達(dá)情況，研究其與臨床分期、病理分級之間的關(guān)系。同時(shí)檢測各腎癌細(xì)胞株中miR-155的表達(dá)情況，篩選合適的體外腎癌細(xì)胞模型，研究其對腎癌細(xì)胞的生物學(xué)行為的影響，如增殖能力，侵襲能力等。繼之用生物信息學(xué)

6、預(yù)測miR-155可能的靶基因，并進(jìn)行了初步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，探討其在腎癌中可能的作用機(jī)制，為腎癌的早期診斷和治療提供新的思路。
　　 第一章 miR-155在人腎透明細(xì)胞癌中的表達(dá)情況及其與臨床分期、病理分級的關(guān)系研究。
　　 目的：探討miR-155在腎透明細(xì)胞癌中的表達(dá)及其意義。
　　 方法：用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測16例ccRCC及癌旁非腫瘤組織中miR-155的表達(dá)情況，研究其與ccRCC臨床分期、病理分級之

7、間的關(guān)系。
　　 結(jié)果：實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在16例ccRcc患者中，與配對的癌旁非腫瘤組織相比，腫瘤組織中miR-155的表達(dá)在94％(15例)的樣本中上調(diào)，僅在一例樣本中下調(diào)，其中ccRCC中miR-155的相對表達(dá)量為2.08～26.05，平均12.70±6.52，癌旁非腫瘤組織中相對表達(dá)量為1.00～6.79，平均2.82±1.25，改變有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。16例ccRCC標(biāo)本中，根據(jù)病理分級樣分組，高

8、分化組miR-155的相對含量為11.43±6.18，中-低分化組為14.33±7.04，沒有顯著差異(P>0.05)。在不同臨床分期組合樣本中，Ⅰ期miR-155的相對含量為13.50±6.55，Ⅱ-Ⅲ期為10.93±6.79，沒有顯著差異(P>0.05)
　　 結(jié)論：
　　 1、ccRCC患者癌組織中的miR-155的表達(dá)水平較癌旁非腫瘤組織明顯上調(diào)，提示miR-155的表達(dá)上調(diào)可能與ccRCC的發(fā)病機(jī)制相關(guān)。

9、>　　 2、在ccRCC患者中，miR-155的表達(dá)的表達(dá)水平與ccRCC的病理分級及臨床分期組合無顯著相關(guān)性。
　　 目的：探討miR-155對腎癌細(xì)胞生物學(xué)性狀的影響，包括細(xì)胞增殖，細(xì)胞凋亡和細(xì)胞侵襲能力的影響。
　　 方法：檢測腎癌細(xì)胞株(ACHN和KC細(xì)胞)中及正常腎小管上皮細(xì)胞株(HK2)中miR-155的表達(dá)情況，結(jié)合細(xì)胞的增殖和分化特征，篩選合適的腎癌細(xì)胞株。使用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染

10、hsa-mir-155 inhibitor于腎癌細(xì)胞株，敲低miR-155的表達(dá)，實(shí)時(shí)定量PCR檢測轉(zhuǎn)染后miR-155表達(dá)，MTT法、Annexin V/PI雙染法和Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)分別觀察細(xì)胞增殖、凋亡及侵襲能力的變化。
　　 結(jié)果：腎癌細(xì)胞株ACHN、KC細(xì)胞，正常腎小管上皮細(xì)胞株HK2的miR-155的相對表達(dá)量分別為9.3，3.0和1.0。選擇ACHN細(xì)胞株作為體外細(xì)胞模型。實(shí)驗(yàn)分為正常細(xì)胞組，陰性對照組，m

11、iR-155抑制組3組。成功轉(zhuǎn)染ACHN胞，結(jié)果顯示抑制組中miR-155的相對含量為1.25±0.22，陰性對照組為7.03±0.18，有顯著性差異(P<0.05)。用MTT法檢測細(xì)胞的生長抑制率，流式細(xì)胞術(shù)檢測其凋亡率，細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)檢測其侵襲能力，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，抑制組細(xì)胞的相對存活率66.6±1.0％，陰性對照組為97.1±1.5％，有顯著性差異(P<0.05)；抑制組ACHN胞的凋亡率為13.76±0.86％，而正常組和陰性

12、對照組的凋亡率分別為5.98±0.44％和7.16±1.07％，有顯著性差異(P<0.05)；Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示侵襲細(xì)胞數(shù)正常組42.17±1.38，對照組41.22±1.65，抑制組14.74±1.06，抑制組相對于正常組和對照組有顯著性差異(P<0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1、hsa-mir-155 inhibitor能有效的轉(zhuǎn)染于ACHN細(xì)胞，降低ACHN細(xì)胞中miR-155的表達(dá)。
　

13、　 2、miR-155的低表達(dá)能使ACHN細(xì)胞增殖受到抑制，凋亡率增加，同時(shí)細(xì)胞的侵襲能力減弱。
　　 3、miR-155在腎癌中可能起著癌基因的作用，通過抑制其表達(dá)，有望達(dá)到治療腎癌的目的
　　 第三章 microrna-155影響腎癌細(xì)胞的機(jī)制探討。
　　 目的：探討miR-155影響ACHN腎癌細(xì)胞的分子學(xué)機(jī)制。
　　 方法：通過生物信息學(xué)方法(如miRanda，Pictar，Targetscan

14、)預(yù)測microrna-155的靶基因，用實(shí)時(shí)定量PCR及Western blot分別檢測對照組和抑制組中的miR-155的表達(dá)量及靶基因蛋白的表達(dá)，初步探討敲低microrna-155對抑制腎癌細(xì)胞生長的作用機(jī)制。
　　 結(jié)果：選擇TargetScan、PicTar和miRanda這3個(gè)軟件對miR-155進(jìn)行靶基因預(yù)測，發(fā)現(xiàn)SOCS-1、BACH1和RAB34為miR-155可能潛在的靶基因。運(yùn)用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)，檢測轉(zhuǎn)染

15、后抑制組和陰性對照組中ACHN中miR-155的相對含量，以U6作為內(nèi)參。結(jié)果顯示抑制組中miR-155的相對含量為1.25±0.22，陰性對照組為7.03±0.18，有顯著性差異(P<0.05)。Western blot顯示SOCS-1的蛋白表達(dá)比值(SOCS-1/GAPDH)在陰性對照組和抑制組中分別為0.053±0.015和0.047±0.006，無顯著性差異(P>0.05)。BACH1的蛋白表達(dá)比值(BACH1/GAPDH)分別

16、為0.125±0.005和0.376±0.015，有顯著性差異(P<0.05)。RAB34的蛋白表達(dá)比值(RAB34/GAPDH)分別為0.164±0.015和0.399±0.091有顯著性差異(P<0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1、ACHN細(xì)胞中miR-155的表達(dá)與BACH1和RAB34蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)性，而與SOCS1蛋白表達(dá)無明顯關(guān)系。
　　 2、BACH1、RAB34可能為miR-155潛在的靶基因