基于柔嫩艾美耳球蟲調(diào)控序列的柔嫩艾美耳球蟲和剛地弓形蟲的瞬間轉(zhuǎn)染.pdf

1、柔嫩艾美耳球蟲屬于頂復(fù)門寄生原蟲，對養(yǎng)禽業(yè)危害巨大。這就需要對它的生物學(xué)特性進行深入的了解。轉(zhuǎn)基因技術(shù)是目前研究生物學(xué)特性的有效手段，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于與柔嫩艾美耳球蟲親緣關(guān)系密切的弓形蟲和瘧原蟲。但是由于體外培養(yǎng)困難等原因，對柔嫩艾美耳球蟲的轉(zhuǎn)染仍然是個巨大的挑戰(zhàn)。本實驗中用黃色熒光蛋白和紅色熒光蛋白作為報告基因，對柔嫩艾美耳球蟲的瞬間轉(zhuǎn)染進行了研究。以卵囊階段提取的基因組DNA為模板，用PCR方法，分別得到了組蛋白4、肌動蛋白、微管蛋白

2、、內(nèi)膜復(fù)合物以及肌動蛋白解聚因子的啟動子。同時用PCR方法也得到了肌動蛋白的下游調(diào)控序列。這樣以黃色熒光蛋白和紅色熒光蛋白為報告基因，其5，端和3，端分別是各個啟動子片段和肌動蛋白下游調(diào)控序列。構(gòu)建了pACT-YFP、pHIS-YFP、 pHIS-RFP、pTUB-YFP、pIMC-RFP和pADF-YFP表達載體。然后用構(gòu)建好的表達載體對柔嫩艾美耳球蟲的子孢子階段進行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染條件是2000V，電容25μF,Cytomix buffe

3、r為電擊介質(zhì)。電轉(zhuǎn)染后室溫靜置20分鐘后接種到MDBK細胞上，置于細胞培箱中進行培養(yǎng)，溫度設(shè)置為41℃。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：用pACT-YFP、pHIS-YFP、pHIS-RFP轉(zhuǎn)染的子孢子可在接種后19小時，可以觀察到EYFP和RFP的表達。接種后43-64小時，可觀察到表達EYFP和RFP的第一代未成熟的裂殖體；在接種后82—84小時，可觀察到表達熒光的第一代成熟的裂殖體以及釋放出的裂殖子。轉(zhuǎn)染效率為15-20個/10<'7>。對于plMC-

4、RFP和pADF-YFP，由于轉(zhuǎn)染效率較低，觀察到的表達熒光的蟲體極少，只有2—5個/10<’7>，只觀察到處于第一代未成熟裂殖體的蟲體。為了探討柔嫩艾美耳球蟲的調(diào)控序列能否驅(qū)動熒光蛋白在弓形蟲體內(nèi)表達，用pACT-YFP、pHIS-YFP、pTUB-YFP對弓形蟲的速殖子階段進行了轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染條件同前。轉(zhuǎn)染后的速殖子接種到MDBK細胞上，在37℃下進行培養(yǎng)。觀察發(fā)現(xiàn)，在速殖子進行分裂形成假包囊直到第二代速殖子釋放出(總共約48小時)的過