宮頸癌INK4a基因過表達(dá)及其與HPV感染的關(guān)系研究.pdf

1、背景與目的：抑癌基因INK4a在多種腫瘤中陰性表達(dá)，但在幾乎100％宮頸癌中過表達(dá)，究其發(fā)生原因，目前尚無定論。人乳頭瘤病毒(humanpapillomavirus，HPV)感染是宮頸癌發(fā)生的必要條件，其中50％以上是HPV16型。HPV的E6和E7基因整合到宮頸上皮細(xì)胞并持續(xù)表達(dá)是引發(fā)宮頸癌的主要原因，同時(shí)也是維持宮頸癌惡性表型的必要條件。宮頸癌INK4a過表達(dá)是否與HPV感染有關(guān)，目前尚無統(tǒng)一認(rèn)識(shí)。本研究擬通過RNA干擾技術(shù)，以抑制

2、HPV16E7表達(dá)，進(jìn)而檢測(cè)對(duì)SiHa和CaSki細(xì)胞INK4a基因表達(dá)的影響；同時(shí)，比較不同HPV感染狀態(tài)的宮頸癌細(xì)胞CaSki(HPV16感染)，HeLa(HPV18感染)，C-33A(無HPV感染)中INK4a表達(dá)水平，綜合分析宮頸癌INK4a過表達(dá)與HPV感染的相關(guān)關(guān)系，初步闡明INK4a基因在宮頸癌中異常表達(dá)的可能機(jī)制，為宮頸癌的預(yù)防和早期診斷提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法： 1.應(yīng)用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)126例H

3、PV感染及未感染宮頸癌(cervicalcancer,CC)、宮頸上皮內(nèi)瘤變(cervicalintraepithelialneoplasia，CIN)及慢性宮頸炎中INK4a表達(dá)規(guī)律及其與HPV感染之間的相互關(guān)系。 2.利用RNA干擾技術(shù)，針對(duì)HPV16E7的siRNA干涉SiHa和CaSki細(xì)胞，使HPV16E7mRNA沉默。 3.應(yīng)用RT-PCR技術(shù)，檢測(cè)HPV16E7siRNA干擾前后SiHa和CaSki細(xì)胞HP

4、V16E7及INK4amRNA。 4.應(yīng)用Westernblot技術(shù)，檢測(cè)HPV16E7siRNA干擾前后SiHa和CaSki細(xì)胞HPV16E7及INK4a蛋白表達(dá)。 5.應(yīng)用流式細(xì)胞儀，檢測(cè)HPV16E7siRNA干擾前后SiHa和CaSki細(xì)胞周期分布情況。 6.聯(lián)合應(yīng)用RT-PCR和Westernblot技術(shù)，比較不同HPV感染狀態(tài)的宮頸癌細(xì)胞CaSki(HPV16感染)，HeLa(HPV18感染)，C-3

5、3A(無HPV感染)中INK4a表達(dá)水平。 結(jié)果： 1.126例宮頸病變組織中INK4a表達(dá)規(guī)律及其與HPV感染之間的關(guān)系。 2.siHPV16E7001，siHPV16E7002，siHPV16E7003干擾CaSki細(xì)胞后，HPV16E7mRNA的含量下降，其中siHPV16E7001干擾后，HPV16E7mRNA的含量下降最明顯，約80％；不同濃度siHPVl6E7001干擾CaSki細(xì)胞后，60nM組干擾

6、效率最強(qiáng)，與未干擾組比較差異有顯著性意義(p＜0.01)，且細(xì)胞毒性輕微。 3.和SiHa-Nontransfection組(0.6033+0.0186)及SiHa-siNControl組(0.5500±0.0173)相比，在SiHa-siHPV16E7組(0.3067±0.0120)中，RT-PCR方法證明其HPV16E7mRNA表達(dá)顯著降低(p＜0.01)，Westernblot方法亦證明SiHa-siHPV16E7組的HP

7、V16E7蛋白表達(dá)量顯著低于SiHa-Nontransfection組和SiHa-siNControl組(p＜0.01)。提示通過RNA干擾方法能有效地抑制SiHa細(xì)胞的HPV16E7表達(dá)。 4.和CaSki-Nontransfection組(1.1733±0.0667)及CaSki-siNControl組(1.3933±0.1667)相比，在CaSki-siHPV16E7組(0.4033±0.0328)中，RT-PCR方法證明

8、其HPV16E7mRNA表達(dá)顯著降低(p＜0.01)，Westernblot方法亦證明CaSki-siHPV16E7組的HPV16E7蛋白表達(dá)量顯著低于CaSki-Nontransfection組和CaSki-siNControl組(p＜0.01)。提示通過RNA干擾方法能有效地抑制CaSki細(xì)胞的HPV16E7表達(dá)。 5.和SiHa-Nontransfection組(1.0033±0.0233)及SiHa-siNControl

9、組(0.9267±0.0371)相比，在SiHa-siHPV16E7組(0.5833±0.0133)中，RT-PCR方法證明其INK4amRNA表達(dá)顯著降低(p＜0.01)，Westernblot方法亦證明SiHa-siHPV16E7組的INK4a蛋白表達(dá)量顯著低于SiHa-Nontransfection組和SiHa-siNControl組(p＜0.01)。提示通過siHPV16E7干擾能有效地抑制SiHa細(xì)胞的INK4a表達(dá)。

10、 6.和CaSki-Nontransfection組(0.7833±0.0088)及CaSki-siNControl組(0.8533±0.0353)相比，在CaSki-siHPV16E7組(0.4767±0.0145)中，RT-PCR方法證明其INK4amRNA表達(dá)顯著降低(p＜0.01)，Westernblot方法亦證明CaSki-siHPV16E7組的INK4a蛋白表達(dá)量顯著低于CaSki-Nontransfection組和CaSk

11、i-siNControl組(p＜0.01)。提示通過siHPV16E7干擾能有效地抑制CaSki細(xì)胞的INK4a表達(dá)。 7.細(xì)胞周期分析結(jié)果表明：HPV16E7干擾SiHa細(xì)胞24h，48h，72h后，G0-G1期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)較SiHa-Nontransfection組依次增加了1.1％，0.7％，31.7％，進(jìn)入S期的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)較SiHa-Nontransfection組依次減少了0.2％，2.5％，6.4％；HPV16E7干擾

12、CaSki細(xì)胞24h，48h，72h后，G0-G1期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)較CaSki-Nontransfection組依次增加了8.7％，12.7％，15.6％，進(jìn)入S期的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)較CaSki-Nontransfection組減少了1.3％，4.3％，14.9％。提示通過siHPV16E7干擾能將更多的細(xì)胞阻滯在G0-G1期。 8.RT-PCR檢測(cè)不同HPV感染狀態(tài)的宮頸癌細(xì)胞CaSki(0.3967±0.0491)，HeLa(0.55

13、67±0.1037)，C-33A(0.5633±0.0722)中INK4amRNA表達(dá)無明顯差異(p＞0.05)；Westernblot方法亦證明CaSki(0.4152±0.0255)，HeLa(0.5094±0.0361)，C-33A(0.5895±0.0409)中INK4a蛋白表達(dá)無顯著性差異(p＞0.05)。提示不同HPV感染狀態(tài)的宮頸癌細(xì)胞中INK4a表達(dá)規(guī)律趨于一致。 結(jié)論： 1.無論是否合并HPV感染，宮頸

14、癌及CIN3組織中INK4a基因都過表達(dá)。 2.siHPV16E7可序列特異性下調(diào)宮頸癌SiHa，CaSki細(xì)胞HPV16E7基因水平，顯著降低HPV16E7蛋白表達(dá)。 3.通過RNA干擾抑制HPV16E7表達(dá)后，能顯著抑制INK4a基因表達(dá)，同時(shí)將更多的細(xì)胞阻滯在G0-G1期。 4.不同HPV感染狀態(tài)的宮頸癌細(xì)胞中INK4a表達(dá)規(guī)律趨于一致。 綜上提示，在合并HPV感染的宮頸癌中INK4a基因過表達(dá)與H