鄰苯二甲酸二丁酯和苯并[a]芘對大鼠睪丸支持細(xì)胞的聯(lián)合毒性研究.pdf

1、隨著人類社會的發(fā)展和工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)規(guī)模的擴(kuò)大，人類排放到水環(huán)境中的污染物越來越多。在眾多的污染物中，有機(jī)污染物占的比例最大，而有機(jī)物中的持久性有機(jī)污染物是一類環(huán)境滯留時間長、難降解、易通過食物鏈富集、危害大的化學(xué)物質(zhì)。除了對其致癌致畸致突變等作用的研究外，如何評價水中有機(jī)物混合污染對人體的危害是研究者們目前面臨的難題。對水中有機(jī)物的檢測發(fā)現(xiàn)，鄰苯二甲酸酯類和多環(huán)芳烴類是污染最為廣泛的兩類化合物，其中鄰苯二甲酸酯類的鄰苯二甲酸二丁酯(dibu

2、tylphthalate，DBP)污染最為嚴(yán)重，而多環(huán)芳烴類的苯并[a]芘[benzo(a)pyrene，BaP]為該類化合物中毒性最強(qiáng)。本研究選用DBP和BaP作為有機(jī)污染物的代表，觀察其單獨(dú)和聯(lián)合作用于體外培養(yǎng)的大鼠睪丸支持細(xì)胞后的毒性效應(yīng)，以期為建立評價有機(jī)物混合污染對人體健康危害的體外檢測方法提供實(shí)驗依據(jù)。 一、體外培養(yǎng)大鼠睪丸支持細(xì)胞模型的建立 選用出生后18-21天的雄性SD大鼠，采用直接二步酶消化法與低滲處

3、理純化法相結(jié)合，并使用低速離心與二次貼壁的方法，制備睪丸大鼠支持細(xì)胞。在細(xì)胞分離后的48h，用20mmol/L Tris-HCl處理生精細(xì)胞，并于細(xì)胞融合80％后消化傳代，用油紅0、堿性磷酸酶染色，并通過透射電鏡和HE染色觀察以及支持細(xì)胞特異性表達(dá)抗原FasL免疫組化鑒別分離的支持細(xì)胞純度。染色后鏡下可見細(xì)胞邊緣不清，胞體呈寬大的柱狀或不規(guī)則狀，有粗大的突起，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見小吞噬物或小空泡，核大呈藍(lán)色，卵圓形或不規(guī)則形，核質(zhì)均勻，多于95

4、％的細(xì)胞胞質(zhì)中有大小不等的紅色脂滴，此為支持細(xì)胞的特異性標(biāo)志之一，生精細(xì)胞與間質(zhì)細(xì)胞均不著紅色。被堿性磷酸酶染色的生精細(xì)胞和管周肌樣細(xì)胞少于1％，透射電鏡可觀察到支持細(xì)胞的特異性結(jié)構(gòu)-衛(wèi)星小體，而分離培養(yǎng)的絕大部分細(xì)胞都能表達(dá)特異性標(biāo)志其功能活性的FasL。通過對其生長曲線的檢測，確定分離后5-9天為其對數(shù)生長期，適合采用此期的支持細(xì)胞進(jìn)行毒理學(xué)實(shí)驗。至此，成功建立體外培養(yǎng)大鼠睪丸支持細(xì)胞模型。 二、DBP和BaP分別及聯(lián)合染毒

5、對大鼠睪丸支持細(xì)胞的毒作用 1.共設(shè)立15個試驗組和2個對照組在2個染毒時間點(diǎn)開展MTT實(shí)驗及細(xì)胞計數(shù)，即以DMSO為溶劑的0.1、1、10、100、500μg/mlDBP各組和0.01、0.1、1、10、50μg/mlBaP各組以及DBP+BaP聯(lián)合染毒(按劑量從低到高依次對應(yīng)聯(lián)合)、DMSO組和空白對照組。實(shí)驗結(jié)果顯示，DBP在一定的劑量下(500μg/ml，12h)可以刺激支持細(xì)胞增殖，隨著染毒時間的增加高劑量刺激增殖作用

6、消失，而較低劑量(100μg/ml，24h)出現(xiàn)刺激增殖的作用。BaP在24h內(nèi)不影響支持細(xì)胞的生長，二者聯(lián)合染毒呈現(xiàn)出與DBP的刺激增殖相似的作用，但高劑量聯(lián)合染毒反而抑制細(xì)胞的增殖。細(xì)胞計數(shù)結(jié)果與此一致。據(jù)此選擇1、10、100μg/mlDBP各組和0.1、1、10μg/mlBaP各組以及DBP+BaP聯(lián)合染毒(按劑量從低到高依次對應(yīng)聯(lián)合)開展所有后續(xù)實(shí)驗。 2.培養(yǎng)液中乳酸含量的高低可以反映支持細(xì)胞的功能。用選定劑量染毒支

7、持細(xì)胞后在12、24、48h三個時間點(diǎn)檢測培養(yǎng)液中的乳酸。DBP在高劑量下(100μg/ml)可以刺激支持細(xì)胞乳酸的分泌，而BaP在短時間內(nèi)(12h)抑制乳酸的分泌，而隨著時間的延長(48h)可顯著刺激乳酸分泌。二者聯(lián)合染毒在12h和24h內(nèi)只有高劑量組(100μg/mlDBP+10μg/ml BaP)刺激乳酸分泌，染毒延長至48h后各組均能刺激乳酸分泌。 3.波形蛋白是細(xì)胞骨架中一種重要中間纖維，在細(xì)胞形態(tài)維持、細(xì)胞運(yùn)動、細(xì)胞

8、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞凋亡等方面起著重要作用。支持細(xì)胞染毒12h后，各染毒組均不引起波形蛋白的表達(dá)變化；24h后，10μg/mlDBP與1μg/mIBaP可誘導(dǎo)波形蛋白表達(dá)下降(p<0.05)，100μg/mlDBP組和10μg/mlBaP組的波形蛋白下降更為顯著(p<0.01)，高劑量聯(lián)合染毒組(100μg/ml DBP+10μg/ml BaP)波形蛋白的表達(dá)出現(xiàn)顯著降低。染毒48h后，DBP和BaP單獨(dú)染毒中、高劑量組與DMSO組相差顯著(

9、分別為P<0.05和P<0.01)，聯(lián)合染毒各組的波形蛋白表達(dá)均顯著減少，該結(jié)果提示DBP與BaP單獨(dú)染毒均可降低支持細(xì)胞波形蛋白的表達(dá)，而且呈劑量依賴關(guān)系，二者聯(lián)合呈現(xiàn)輕度相加作用。高劑量組染毒后細(xì)胞波形蛋白形狀發(fā)生變化，從多變形收縮成索狀或圓形，細(xì)胞間的空隙明顯增大。 4.微管蛋白是一種具有多種功能的細(xì)胞骨架蛋白，對微管蛋白的損傷將影響生精上皮的結(jié)構(gòu)和支持細(xì)胞對生精細(xì)胞的支持作用。各染毒組12h后細(xì)胞內(nèi)的α-tubulin蛋

10、白的表達(dá)未見改變；染毒24h后，BaP高劑量組α-tubulin蛋白表達(dá)明顯增加(P<0.05)；48h后，DBP高劑量組的α-tubulin蛋白表達(dá)顯著上升(P<0.05)，BaP低劑量組和中劑量組與DMSO組相比α-tubulin表達(dá)增加(P<0.05)，高劑量組增加的幅度更大(P<0.01)。令人感興趣的是聯(lián)合染毒各組并沒有出現(xiàn)顯著變化，說明二者的聯(lián)合作用對支持細(xì)胞α-tubulin的影響要小于二者單獨(dú)染毒。該結(jié)果提示DBP和Ba

11、P均可以干擾支持細(xì)胞的微管蛋白，BaP的強(qiáng)度大于DBP，但是二者聯(lián)合染毒后該干擾作用消失，呈現(xiàn)拮抗效應(yīng)。 5.支持細(xì)胞分泌的抑制素(inhibin，INH)和轉(zhuǎn)鐵蛋白(transffen，Tf)在生精過程的調(diào)節(jié)中具有重要作用。DBP染毒12h以后并不影響INH B和Tf mRNA表達(dá)；24h后，三個劑量組均刺激INH B的表達(dá)，而僅高劑量組刺激Tf表達(dá)。但48h后，均顯著抑制INH B和Tf mRNA的表達(dá)，具有劑量依賴關(guān)系。B

12、aP染毒12h后，中、高劑量組INH B的表達(dá)均顯著下降，呈劑量依賴關(guān)系，而對Tf的表達(dá)無影響；24h后，高劑量組延續(xù)對INH B的抑制，而三個組均可刺激Tf的表達(dá)；染毒時間延長至48h后，BaP三個組對INH B和Tf均有顯著抑制作用。DBP和BaP聯(lián)合后二者對INH B的影響表現(xiàn)為拮抗效應(yīng)，而對Tf的作用與單獨(dú)作用相一致。 三、DBP和BaP分別及聯(lián)合染毒對大鼠睪丸支持細(xì)胞MAPK途徑的影響 采用功能基因芯片檢測10

13、μg/ml DBP、1μg/ml BaP和二者聯(lián)合染毒組MAPK途徑相關(guān)基因的變化，并用Western blot檢測全部9個染毒組及DMSO組的ERK、JNK和P38及各自磷酸化水平的變化。結(jié)果如下： 1.10μg/ml DBP染毒后Egr1、c-fos、Ksr1、HPK1、Jnk3、ERKI、NFAT3、RPLP1這8個基因與對照組比顯著下調(diào)，而p388顯著上調(diào)。該結(jié)果提示，DBP染毒后對MAPK的三條通路：ERK1/2、JN

14、K/SAPK、P38MAPK均有影響，除此之外還可改變早期的反應(yīng)基因以及HPK1、Ksr1等MAPK通路上游分子的表達(dá)。用western blot檢測蛋白表達(dá)顯示，DBP染毒后各組總ERK的變化不顯著，該結(jié)果與erk基因顯著下調(diào)不一致，p-ERK的表達(dá)各實(shí)驗組增加，呈劑量反應(yīng)關(guān)系；各組JNK/SAPK總蛋白和磷酸化的JNK1/2的表達(dá)明顯下降，且呈劑量反應(yīng)關(guān)系；從10μg/mIDBP開始誘導(dǎo)P38表達(dá)增加，呈劑量反應(yīng)關(guān)系，但各組磷酸化水

15、平并沒有顯著差異。 2.1μg/ml BaP染毒后，MAPK通路僅有Jnk3一個基因顯著下調(diào)。蛋白檢測發(fā)現(xiàn)，總ERK未見顯著變化，而p-ERK的表達(dá)各組均有增加；JNK/SAPK總蛋白的表達(dá)各組略有降低，而p-JNK各組均下降，呈劑量反應(yīng)關(guān)系；BaP各組對支持細(xì)胞P38的表達(dá)無影響。 3.DBP+BaP聯(lián)合染毒后，與DMSO組相比僅4個基因發(fā)生變化：Cyclin D2和p386顯著上調(diào)，而Egr1和c-fos顯著下調(diào)，該

16、結(jié)果表明聯(lián)合染毒對MAPK途徑的影響要小于DBP單獨(dú)染毒。而聯(lián)合染毒組和DBP組相比，Cyclin D2、Ksrl、ERK1、NFAT3、RPLP1和Mknkl共7個基因上調(diào)，該結(jié)果提示，加入BaP后，DBP單獨(dú)染毒使支持細(xì)胞發(fā)生的基因表達(dá)變化得到修正，這上調(diào)的7個基因在DBP單獨(dú)染毒時均下調(diào)，二者聯(lián)合呈現(xiàn)拮抗效應(yīng)，這與第二部分實(shí)驗中多項指標(biāo)顯示DBP與BaP聯(lián)合染毒后出現(xiàn)拮抗效應(yīng)相一致。蛋白結(jié)果顯示，聯(lián)合染毒各組總ERK未見顯著變化，

17、而p-ERK的表達(dá)較DBP染毒組高；聯(lián)合染毒的高劑量組JNK/SAPK總蛋白的表達(dá)與對照比下降，而p-JNK表達(dá)量反而高于各單獨(dú)染毒組；總P38的變化趨勢與DBP各組相似，隨著染毒劑量的升高而表達(dá)增加，但各組磷酸化水平并沒有顯著差異。 總之，一定劑量的DBP可以刺激睪丸支持細(xì)胞的增殖，DBP和BaP均可以刺激乳酸的分泌(BaP為先抑制后刺激)，二者均可降低波形蛋白和增加微管蛋白α的表達(dá)，對INH B和Tf的作用表現(xiàn)為先刺激后抑制