甲型H1N1流感病毒血凝素基因的表達(dá)和免疫原性分析.pdf

1、流感病毒(influenza virus)是引起人類(lèi)呼吸道感染及引起人類(lèi)死亡的主要病因之一。人類(lèi)曾多次遭受過(guò)流感病毒大流行(1918年H1N1亞型，1957年H2N2亞型，1968年H3N2亞型，1977年H1N1亞型)。至今人類(lèi)仍然無(wú)法征服流感病毒?？焖贆z測(cè)及接種疫苗被認(rèn)為是控制并清除流感病毒經(jīng)濟(jì)有效的手段。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)流感病毒具有快速、特異性高的特點(diǎn)，但花費(fèi)昂貴，不適合大面積推廣；當(dāng)前使用的疫苗有流感減毒疫苗、滅活疫苗、裂

2、解疫苗等，這些疫苗能夠在人體中產(chǎn)生保護(hù)性抗體，但是都有一定的缺陷，如減毒疫苗具有毒力回復(fù)的潛在性危險(xiǎn)，而后兩種卻很難產(chǎn)生細(xì)胞免疫應(yīng)答。因此，迫切需要研制一種快速的檢測(cè)流感病毒的方法及新型有效的疫苗。
　　 當(dāng)前發(fā)表的許多文章都證實(shí)了流感病毒糖蛋白抗原的保護(hù)性作用，在這些糖蛋白抗原中，血凝素(HA)的作用相當(dāng)重要。HA具有免疫原性，抗血凝素抗體可以中和流感病毒，是主要的保護(hù)性抗原。因此，針對(duì)HA蛋白的重要性，以GenBank公布的

3、A/California/05/2009H1N1流感病毒HA基因?yàn)槟康幕?，從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中下載HA基因序列，進(jìn)行全基因合成，將人工合成的甲型H1N1流感病毒的HA基因克隆到原核表達(dá)載體pET30a+上，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)，以IPTG對(duì)重組菌BL21(DE3)(pET-HA)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物His-HA融合蛋白通過(guò)變復(fù)性后純化。Western blot試驗(yàn)結(jié)果表明表達(dá)產(chǎn)物His-HA融

4、合蛋白能特異性地與人甲型H1N1流感患者陽(yáng)性血清反應(yīng)，證明表達(dá)產(chǎn)物His-HA融合蛋白具有免疫反應(yīng)活性。利用該His-HA融合蛋白的建立檢測(cè)抗體的ELISA方法，并探究ELISA方法的最適宜條件，ELISA方法的適宜條件為原核表達(dá)產(chǎn)物His-HA融合蛋白以1μg/孔包板，檢測(cè)血清的稀釋度為1:80到1:640間；以建立的ELISA檢測(cè)300份人源血清樣品，陽(yáng)性血清數(shù)量為74份，陽(yáng)性率為24.67％，并與商品化試劑盒進(jìn)行對(duì)比，符合率為98

5、.65％，對(duì)比試驗(yàn)說(shuō)明建立的ELISA方法具有可行性。
　　 將人工合成的甲型H1N1流感病毒的HA基因克隆到pFastBac1轉(zhuǎn)移載體，轉(zhuǎn)化DH5a，然后在含Kan抗生素的LB平板上挑取陽(yáng)性菌落，得到的重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pFastBac-HA，再提取陽(yáng)性克隆質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到含桿狀病毒穿梭載體Bacmid的受體菌E.coli DH10Bac中，發(fā)生轉(zhuǎn)座作用，在含慶大霉素、卡那霉素、四環(huán)素3種抗生素和X-gal/IPTG的LB培養(yǎng)板上，篩選出

6、白色菌落得到重組穿梭載體Bacmid-HA。經(jīng)PCR鑒定為陽(yáng)性后，采用陽(yáng)離子脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染到Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞獲得重組桿狀病毒，通過(guò)IFA、SDS-PAGE及Western blot試驗(yàn)證實(shí)在Sf9細(xì)胞中HA蛋白得到表達(dá)。血凝試驗(yàn)結(jié)果表明表達(dá)產(chǎn)物HA蛋白血凝價(jià)為1:16，血凝試驗(yàn)證實(shí)真核表達(dá)產(chǎn)物具有生物活性。將真核表達(dá)的HA蛋白以100μg/只的劑量，通過(guò)皮下注射BALB/c小鼠，探討其免疫原性，ELISA檢測(cè)免疫小鼠血清的抗體效價(jià)，結(jié)果顯示