ESA和STAg鼻內(nèi)免疫小鼠誘導(dǎo)的抗弓形蟲感染保護(hù)性免疫應(yīng)答.pdf

1、本文研究目的：首先篩選體外制備弓形蟲排泄-分泌抗原(excreted/secreted antigen，ESA)的最適條件，再觀察兩種不同來源的弓形蟲ESA(即Vero細(xì)胞體外培養(yǎng)弓形蟲獲取的ESA和感染鼠腹水中分離的ESA)以及可溶性速殖子抗原(soluble tachyzoite antigen，STAg)鼻內(nèi)免疫小鼠誘導(dǎo)的黏膜及系統(tǒng)免疫應(yīng)答及其抗弓形蟲感染的能力。探討三種抗原鼻內(nèi)免疫誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答及抗感染機(jī)制，為弓形蟲鼻內(nèi)復(fù)合疫苗

2、的研制奠定理論基礎(chǔ)。 研究方法：分三部分： 第一部分、觀察弓形蟲與Vero細(xì)胞不同共培養(yǎng)條件對ESA含量的影響。首先觀察不同血清濃度及含血清培養(yǎng)時間對ESA蛋白濃度的影響。按血清濃度0.5％、1％、2％、4％分4組，組內(nèi)又按含血清培養(yǎng)時間(3h、6h、12h、24h)分4個時間點。弓形蟲速殖子與Vero細(xì)胞分別在含不同濃度血清的培養(yǎng)基中共培養(yǎng)，并分別于3h、6h、12h或24h后改為無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，第7d收集培養(yǎng)上

3、清液并檢測蛋白含量。其次觀察共培養(yǎng)時間及含血清培養(yǎng)時間對ESA蛋白濃度的影響。按共培養(yǎng)時間(7d、9d、11d、13d)分為4組，組內(nèi)又按不同的含血清培養(yǎng)時間(12h、24h、48h、72h)分4個時間點。弓形蟲速殖子與Vero細(xì)胞在含1％血清的培養(yǎng)基中共培養(yǎng)，各組分別于培養(yǎng)12h、24h、48h、72h后改為無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，并分別于第7d、9d、11d、13d收集培養(yǎng)上清液，檢測蛋白含量。 第二部分、觀察兩種不同來源的E

4、SA及STAg鼻內(nèi)免疫小鼠誘導(dǎo)的黏膜及系統(tǒng)免疫應(yīng)答。BALB/c小鼠隨機(jī)分為4組，分別用PBS 20μl/只、體外ESA、腹腔ESA或STAg各20μg/只鼻內(nèi)免疫2次，間隔14d。分別于末次免疫后14d和44d處死，計數(shù)腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞(intestinal intraepithelial lymphocytes，IEL)和脾淋巴細(xì)胞，檢測血清IgG和腸液sIgA。 第三部分、觀察兩種不同來源的ESA及STAg鼻內(nèi)免疫小鼠誘導(dǎo)

5、的抗弓形蟲作用。BALB/c小鼠隨機(jī)分為4組，分別用PBS 20μl/只、體外ESA、腹腔ESA和STAg各20μg/只鼻內(nèi)免疫2次，間隔14d。末次免疫后14d用1×10<'4>個速殖子/只灌胃攻擊，觀察小鼠健康狀況及體重變化，攻擊后30d處死小鼠，計數(shù)脾、腦內(nèi)速殖子。 研究結(jié)果：弓形蟲速殖子與Vero細(xì)胞在不同培養(yǎng)條件中共培養(yǎng)，培養(yǎng)基中血清濃度為l％、共培養(yǎng)12h或24h改為無血清培養(yǎng)基所提取的ESA蛋白含量明顯高于其它培養(yǎng)

6、條件(P<0.05)。12h或24h改為無血清培養(yǎng)基并在共培養(yǎng)第13d收集培養(yǎng)上清液獲取的ESA蛋白含量顯著高于其它時間點(P<0.001)。 體外ESA、腹腔ESA和STAg鼻內(nèi)免疫小鼠后，腹腔ESA組小鼠狀態(tài)欠佳，其它各組小鼠健康狀況良好。末次免疫后14d，各抗原組脾淋巴細(xì)胞(P<0.05)及IEL(P<0.01)均增殖活躍，至免疫后44d，兩種ESA組脾淋巴細(xì)胞數(shù)及：IEL仍高于PBS組(P<0.05)。與PBS組比較，各

7、抗原組血清IgG水平在免疫后14d(P<0.001)和44d(P<0.05)均明顯增高。腸液sIgA水平，體外ESA(P<0.05)、腹腔ESA(P<0.001)和STAg(P<0.001)組在免疫后14d明顯高于PBS組，兩種ESA組在免疫后44d仍與PBS組有差異(P<0.05)。體外ESA、腹腔ESA和STAg鼻內(nèi)免疫小鼠后，腹腔ESA組小鼠出現(xiàn)輕微豎毛、倦怠等異常表現(xiàn)，其它各組小鼠健康狀況良好。攻蟲后，PBS組小鼠體重逐漸降低，

8、15d后逐漸趨于平緩，而體外ESA組和STAg組(P<0.05)小鼠體重仍呈增高趨勢，腹腔ESA組未見明顯升高。各抗原組脾、腦組織內(nèi)蟲荷顯著低于PBS組(P<0.01)。 研究結(jié)論：弓形蟲速殖子與Vero細(xì)胞在含1％血清的培養(yǎng)基中共培養(yǎng)12h或24h后，換無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，第13d收集培養(yǎng)上清可獲得較高含量的弓形蟲ESA。體外ESA、腹腔ESA和STAg鼻內(nèi)免疫均可誘導(dǎo)黏膜及系統(tǒng)的細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答，產(chǎn)生抗弓形蟲感染的部分保