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文檔簡介
1、本文在前人已有的工作基礎上,應用生理、生態(tài)和分子生物學相結合的方法,研究確定了粘蟲Mythimnaseparata(Walker)遷飛與生殖的關鍵時期及其在進化上的適應意義,明確了可對關鍵時期起作用的三種環(huán)境因子及其相應的作用,確定了保幼激素(JH)釋放量的增加是遷飛個體轉化為居留個體的主要原因,克隆和鑒定了對JH具有調控作用的粘蟲促咽側體激素(Mytse-AT)基因,并獲得了該基因編碼區(qū)的全序列,明確了Mytse-AT基因的半表達量和
2、相對表達量與JH滴度的關系,得到了對粘蟲具有生物活性即可以對其關鍵時期起作用的AT重組蛋白,為全面闡明粘蟲的遷飛行為機制提供了新的科學依據,為深化昆蟲遷飛研究的理論與應用實踐開辟了新的途徑。主要的研究結果如下: 研究確定了粘蟲遷飛個體轉化為居留個體的關鍵時期及其在進化適應中的意義。以遷飛個體的產卵前期較長飛行能力越強的理論為依據,對室內誘導的遷飛個體羽化后的不同時期進行饑餓處理的結果表明,成蟲羽化后的24-30小時內進行超過12
3、小時的饑餓,可以使處理成蟲的求偶和產卵前期縮短,產卵量增加,而在其它時間進行處理則沒有這種效果。表明成蟲羽化后的24小時是粘蟲遷飛與生殖調控的關鍵時期。即在成蟲羽化前的發(fā)育過程中形成的遷飛行為在羽化以后的24小時內依然可以改變。但是,同樣的環(huán)境因子對不同發(fā)育階段的居留型成蟲個體則沒能產生相同的影響作用:羽化后24小時處理的成蟲與2、3日齡處理的產卵前期雖然比對照的有所延長,但1-3日齡之間的處理并沒有顯著差異,另外,1日齡處理的產卵量及
4、壽命等與對照的也沒有顯著的差異。這些結果表明,雖然遷飛個體可以在可操縱因素的影響下向非遷飛個體轉變,非遷飛個體轉化為遷飛個體的過程可能是不可逆的,因此,遷飛個體要比居留型的生活史彈性要強。這些結果較好地回答了遷飛種群較非遷飛種群的適應能力更強的問題。 研究明確了對關鍵時期可以起作用的一些環(huán)境因子及相應的影響作用。進一步就低溫、光照等環(huán)境因子對處于不同發(fā)育階段的遷飛個體進行處理的結果也表明,光照和低溫與饑餓處理一樣,對羽化后24小
5、時內的遷飛個體的產卵前期具有影響作用,即可以顯著地縮短成蟲的生殖前期,并使產卵量增加。這樣,低溫和光照處理處理都可以使遷飛個體轉變?yōu)樯硞€體,但對羽化24小時以后的成蟲進行同樣的處理則對其產卵前期沒有影響,表明處于關鍵時期的遷飛成蟲個體對于來自不同的環(huán)境生理因子的刺激十分敏感。但是,這些環(huán)境因子的刺激必須要達到一定的程度才能產生作用:溫度必須在5℃的條件下才能發(fā)生作用,而在10℃和15℃的條件下沒有作用;饑餓則必須大于6小時才會發(fā)生作用
6、,光照只有在24小時長光照的條件下才能發(fā)生作用,而在24小時全黑暗或在短光照的條件下沒有作用。但是,相同強度的低溫和光照對居留型相同時期進行的處理則沒能改變其產卵前期或產卵量,即處理與對照的沒有顯著差異。這些結果的獲得再次表明,居留型個體的生活史彈性或對環(huán)境的適應能力比遷飛型的要弱,因為遷飛個體在羽化后的24小時內,如果遇到低溫或找不到補充營養(yǎng),就可放棄遷飛而留在本地生殖,而其生殖能力不會受到影響,但居留型個體無論環(huán)境條件如何變化,都只
7、能留在本地生殖。這些結果對于闡明粘蟲遷飛行為的發(fā)生規(guī)律提供了更進一步的科學依據。 研究明確了JH提前分泌是上述環(huán)境因子使遷飛個體轉變?yōu)闇魝€體的主要原因。為了闡明主要環(huán)境因子對關鍵時期的影響作用機制,應用傳統(tǒng)的研究思路對處理過的1日齡成蟲的卵巢發(fā)育、飛行肌降解程度、飛行能力以及保幼激素的變化規(guī)律進行了研究。所獲的結果表明,經饑餓處理的遷飛型初羽化成蟲卵巢發(fā)育速度明顯加快,處理后24-144小時的卵巢發(fā)育級別一直顯著高于對照的;處
8、理成蟲中胸背縱肌重量在處理后的72小時內與對照的沒有顯著差異,但在96小時后明顯低于對照的,到120小時后差異達到顯著水平,表明處理成蟲的飛行肌降解速度顯著加快;處理后24-72小時成蟲的飛行能力沒有顯著差異,但在96-144小時的飛行能力顯著低于對照成蟲的,這與飛行肌降解的水平相一致;經饑餓處理后的成蟲二種JH(JHⅠ和JHⅡ)滴度也有較大的差異,JHⅠ在羽化后120小時之間差異不明顯,但到144小時后差異十分明顯。JHⅡ不同日齡之間
9、差異較大,羽化后24h內的滴度明顯低于其它日齡。處理后24小時,JHⅡ與對照的即產生明顯的差異,到處理后的120h,差異達到最大。表明JHⅡ可能是控制粘蟲卵巢和飛行能力的發(fā)育、飛行肌降解的主要內分泌調控因子。這樣,由于已經明確粘蟲的卵巢和飛行能力的發(fā)育,以及飛行肌的降解都受JH的調控,而本文所得的結果又與已有的研究結果相一致,因而可以認為,遷飛個體的咽側體(CA)在初羽化時是沒有活性的,但由于饑餓、低溫等環(huán)境因子的刺激,初羽化遷飛個體的
10、咽側體得到了活化,從而使得JH提前釋放是導致遷飛個體轉化為居留個體的主要原因。 研究獲得了對JH釋放具有調控作用的粘蟲促咽側體激素(Mytse-AT)基因編碼區(qū)的全序列。雖然上述研究闡明了JH是導致粘蟲遷飛個體轉變?yōu)榫恿魝€體的主要內分泌因子,但是對粘蟲JH釋放具有調控作用的因子目前并不清楚。為此,以雌蛾腦cDNA為模板,應用分子生物學方法獲得Mytse-AT基因之后,經序列分析確定了編碼區(qū)全長為411bp,編碼區(qū)為136個氨基酸
11、,分子量為15.385KD,等電點為5.245的Mytse-AT基因。成熟的Mytse-AT多肽位于第39至52個氨基酸殘基。其序列和純化的Manse-AT多肽及煙草天蛾的AT基因預測的氨基酸序列完全相同。該基因與其近源種,一點粘蟲Pseudaleciaunxipunxcta的AT前體蛋白基因的同源性高達97%。雖然Mytse-AT基因的全部功能并沒有明確,但由于已經知道Manse-AT多肽具有促進鱗翅目昆蟲分泌JH的作用,再加上前體中
12、成熟的AT多肽的氨基酸序列也與已知的煙草天蛾AT多肽氨基酸序列同源性達100%,據此初步認為,初羽化的粘蟲遷飛個體的AT以及CA都沒有活化,當粘蟲腦受到外界環(huán)境因子的刺激后,Mytse-AT基因表達的活性物質激活了咽側體,并開始分泌JH,從而使遷飛個體轉化為居留個體。但更深層次的機理依然需要進一步的研究。 研究明確了Mytse-AT基因的表達量與JH滴度的動態(tài)關系。為了驗證Mytse-AT基因在成蟲期的表達水平是否與JH滴度的變
13、化水平相吻合,應用半定量RT-PCR和適時熒光定量PCR對經過低溫處理的遷飛個體進行了分析。所獲的結果表明,半定量RT-PCR分析的結果與JH滴度水平的吻合程度較高,對照成蟲羽化后24h、72h內的表達量極低,羽化后48h略有一些表達量,大量的表達則出現在羽化后96-144h之間,而對于經過饑餓處理的成蟲而言,相同時間的Mytse-AT表達量均大于對照的,其中以處理后96h的表達量最大,第120h減少。用適時熒光定量PCR分析所得的結果
14、與血淋巴內JH以及半定量RT-PCR分析的結果也比較一致,除了經過饑餓處理的成蟲沒有像JH滴度和半定量分析的那樣在羽化后120h出現較大的峰值。Mytse-AT基因的表達量與JH,尤其是JHⅡ滴度的時序變化相一致的結果表明,1日齡饑餓對于AT基因的表達量具有明顯的促進作用。綜合分析的結果說明,在羽化后最初幾天,AI表達量的變化和JH的滴度基本上是呈正相關,正是由于AT蛋白量的增加,激活了CA,并使其合成和釋放JH滴度的速度增加,從而使遷
15、飛個體轉化為居留型個體。 根據Mytse-AT基因的序列特征設計了一對特異性引物,并優(yōu)化了蛋白純化的步驟和方法,獲得了對粘蟲關鍵時期或對CA具有活性或可以提高JH滴度的AT外源重組蛋白。主要的證據是:AT外源重組蛋白的使用可以顯著地縮短粘蟲遷飛個體的產卵前期,而使用空載體或丙酮處理的成蟲與對照的沒有顯著差異;上述章節(jié)已經明確,粘蟲的產卵前期或卵巢發(fā)育的速度均受到JH的調控,Mytse-AT基因的時序表達量與JH滴度的動態(tài)關系緊密
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