新型流感通用疫苗研究.pdf

1、流感病毒是一種重要的傳染源?？梢砸鹆鞲斜l(fā)流行。通用流感疫苗已經(jīng)研制多年。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一些保守抗原靶位，如HA2，M2和NP蛋白。血凝素C端的HA2形成莖部結(jié)構(gòu)錨定在病毒囊膜中,引起病毒囊膜與細(xì)胞膜的融合和病毒粒子核衣殼的釋放。血凝素 C端的HA2形成莖部結(jié)構(gòu)錨定在病毒囊膜中,引起病毒囊膜與細(xì)胞膜的融合和病毒粒子核衣殼的釋放。以往的研究表明，HA2是一個(gè)重要的保守性抗原，可能用于通用的研究。
　　目的：本研究旨在通過(guò)選擇流感病毒

2、保守抗原片段，獲得可對(duì)各種流感病毒具有保護(hù)作用的通用疫苗，利用優(yōu)化編碼病毒抗原密碼子策略，同時(shí)采用CD40L作為分子佐劑，獲得可顯著提高免疫效果的流感疫苗。
　　方法：本研究擬將 CD40L作為佐劑，采用病毒載體在體內(nèi)真核表達(dá) HA2基因與CD40L基因重組表達(dá)融合蛋白的策略。CD40L序列的加入可以使融合蛋白通過(guò)CD40L與免疫效應(yīng)細(xì)胞APC和B細(xì)胞，直接激活免疫系統(tǒng)，。CD40L可與APC表面的CD40結(jié)合，從而誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T

3、淋巴細(xì)胞（CTLs）的活化，釋放IFN-γ，使CTLs直接殺傷感染細(xì)胞。另一方面，CD40L與B細(xì)胞表面的CD40結(jié)合，可以使刺激B細(xì)胞活化的抗原閾值降低，誘導(dǎo)B細(xì)胞針對(duì)其所攜帶抗原 HA2的活化和增殖、促進(jìn) HA2特異性的免疫球蛋白類型轉(zhuǎn)換、抗體合成和分泌。此外，SHAF2CD40L復(fù)合物也可誘導(dǎo) DC細(xì)胞分泌一系列重要的細(xì)胞因子和趨化因子，進(jìn)一步上調(diào) T細(xì)胞表面CD40L的表達(dá)。
　　本研究首先通過(guò) PCR拼接及酶切連接的方法

4、重組出 HA2、SHA2、SHA2FCD40L、SFCD40L、HA2FCD40L、SFCD40L及S2HA2FCD40L共6個(gè)基因重組片段，其中 S2HA2FCD40L為優(yōu)化密碼子的重組質(zhì)粒。將這6個(gè)重組基因通過(guò)穿梭質(zhì)粒插入腺病毒載體。
　　選取 SHA2、SHA2FCD40L、S2HA2FCD40L及空載體對(duì)照組進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。對(duì)于每種腺病毒，小鼠體內(nèi)融合蛋白功能實(shí)驗(yàn)均包括2個(gè)部分：病毒攻擊保護(hù)實(shí)驗(yàn)和免疫效果檢測(cè)。同時(shí)為了對(duì)各組

5、腺病毒免疫保護(hù)效果進(jìn)行全面觀察，每種腺病毒分為1×107PFU/只、1×108PFU/只、1×109PFU/只三個(gè)劑量組進(jìn)行免疫。
　　為了觀察疫苗組小鼠抵抗感病毒的保護(hù)能力，分別用5LD50 H1N1（PR8株）和H9N2流感病毒進(jìn)行攻毒，觀察小鼠在不同劑量組（107PFU、108PFU、109PFU）的生存率、體重下降、肺部及鼻腔病毒滴度等指標(biāo)。
　　結(jié)果：Western－blot結(jié)果表明，構(gòu)建的6種腺病毒在Hela細(xì)胞

6、內(nèi)均可表達(dá)出目的大小的融合蛋白。用HA抗體和CD40L抗體分別檢測(cè)的結(jié)果分別證實(shí)了6種融合蛋白大小及抗原性均正確。免疫熒光的結(jié)果表明，所有6種腺病毒均可以在細(xì)胞膜上檢出，說(shuō)明這6種融合蛋白具有接近天然的生物活性。
　　小鼠體內(nèi)免疫應(yīng)答檢測(cè)結(jié)果表明，在第一次免疫兩周后，腺病毒載體SHA2FCD40L、S2HA2FCD40L疫苗3個(gè)劑量組都能夠檢測(cè)到分泌TNF-α，IFN-γ及IL-4的T細(xì)胞。此外，細(xì)胞免疫應(yīng)答的水平與疫苗的免疫劑量

7、呈現(xiàn)出正相關(guān)的關(guān)系，即隨著免疫劑量的增加，誘導(dǎo)機(jī)體的細(xì)胞免疫應(yīng)答的水平也隨之上升。二次免疫后，SHA2FCD40L,S2HA2FCD40L和SHA2組刺激產(chǎn)生的細(xì)胞因子明顯增多。其中Ad-S2HA2FCD40L誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答較強(qiáng)。與初次免疫相比，二次加強(qiáng)免疫能夠顯著性地增強(qiáng)機(jī)體的細(xì)胞免疫應(yīng)答水平，并且細(xì)胞免疫應(yīng)答水平與免疫劑量呈正相關(guān)。雖然流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果表明腺病毒空載體可以刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答,但綜合ELISPOT結(jié)果分析不是針對(duì)

8、HA2蛋白產(chǎn)生特異性的免疫應(yīng)答。
　　體液免疫檢測(cè)結(jié)果表明，AD-SHA2、AD-SHA2FCD40L和AD-S2HA2FCD40L三種腺病毒載體疫苗組都能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答。體液免疫應(yīng)答的水平與疫苗的免疫劑量呈正相關(guān)，其中后2組有更高的IgG和IgA抗體分泌，
　　動(dòng)物保護(hù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，109PFU的AD-SHA2腺病毒載體疫苗對(duì)PR8和H9N2有一定的交叉保護(hù)作用，其體內(nèi)的病毒滴度水平也相對(duì)較低。小鼠肺部和鼻腔中