人食管癌及癌旁間質(zhì)干樣細胞分離培養(yǎng)及生物學特性研究.pdf

1、目的：探討人食管癌間質(zhì)干樣細胞(mesenchymal stem-like cells from human esophageal carcinoma,hEC-MSCs)及癌旁間質(zhì)干樣細胞(mesenchymal stem-like cells from human esophageal carcinoma adjacent non-cancerous tissues,hECN-MSCs)體外分離培養(yǎng)方法,鑒定其生物學特性,并對兩者進行

2、比較。
　　 方法：采用膠原酶消化法從25例人食管癌及癌旁組織中分離培養(yǎng)hEC-MSCs及hECN-MSCs,在含有15%FBS的低糖DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)、增殖并傳代;流式細胞儀檢測表面標記和細胞周期,繪制生長曲線,檢測染色體核型,進行形態(tài)學、細胞化學與分子遺傳學分析;提取細胞總RNA,逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,檢測細胞相關基因的表達情況;成骨誘導和成脂誘導檢測其多向分化潛能;免疫組織化學技術從蛋白水平比較hEC-MSCs和hECN-M

3、SCs中a-SMA、CK18、Nanog及VEGF表達差異;細胞增殖實驗、劃痕實驗和平板克隆實驗比較hEC-MSCs和hECN-MSCs的條件培養(yǎng)液(conditioned medium,CM)對食管癌細胞系EC-1.17的生長、增殖及遷移能力的影響。
　　 結(jié)果：膠原酶消化法分離的25例人食管癌及癌旁組織中,共分離培養(yǎng)出5例配對的hEC-MSCs和hECN-MSCs,所有實驗均采用配對細胞進行研究和比較。在形態(tài)上兩者均呈長梭形

4、,NAP、POX染色均為陰性,PAS染色hECN-MSCs為陽性,而hEC-MSC為弱陽性;生長曲線、細胞周期檢測顯示hEC-MSCs增殖速率明顯高于hECN-MSCs;兩者均表達干細胞相關基因Oct-4、Nanog、BMI-1及Nucleostemin及間質(zhì)細胞相關基因Vimentin、N.cadherin、TGF-β、Twist、a-SMA、Snail、VEGF和IGF-1,不表達上皮細胞相關基因E-cadherin;相比較hECN

5、-MSCs,hEC-MSCs高表達VEGF、BMI-1、Nanog和Oct-4;流式細胞術結(jié)果表明兩者均表達間質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells,MSCs)相關表面標記CD13、CD29、CD44及CD105,不表達造血或內(nèi)皮細胞的相關標記CD45、CD133、CD34及HLA-DR;相比較hECN-MSCs,hEC-MSCs中CD105表達更強;免疫組織化學分析顯示,和hECN-MSCs相比,CK18和VEGF在h

6、EC-MSCs中表達更強,對于a-SMA,兩者表達強度相似,而Nanog在hEC-MSCs中呈弱表達,在hECN-MSCs中不表達。hEC-MSCs和hEN-MSCs均含有46條染色體,核型正常,均具有分化為成骨細胞及脂肪細胞的潛能。細胞增殖實驗、劃痕實驗和平板克隆實驗表明,相對hECN-MSCs的CM(conditioned medium of hECN-MSCs,hECN-MSCs-CM)而言,hEC-MSCs的CM(conditi

7、oned medium of hEC-MSCs,hEC-MSCs-CM)具有更強地促進食管癌細胞系EC-1.17生長、增殖及遷移的能力。
　　 結(jié)論：采用膠原酶消化法能有效分離hEC-MSCs和hECN-MSCs,兩種細胞的生物學特性存在一定的差異;在細胞生長速率、細胞周期及CM對EC-1.17細胞影響等方面差異較為明顯,其原因可能與構(gòu)成腫瘤基質(zhì)的hEC-MSCs能夠分泌某些細胞因子有關,這些細胞因子也許與食管癌的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)