真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物的化學(xué)多樣性開(kāi)發(fā)及生物活性研究.pdf

1、本文從微生物菌株培養(yǎng)條件多樣性獲得代謝產(chǎn)物多樣性和從不同植物來(lái)源的內(nèi)生菌中尋找次級(jí)代謝產(chǎn)物多樣性兩方面入手，開(kāi)展微生物抗腫瘤活性次級(jí)代謝產(chǎn)物的研究。研究?jī)?nèi)容包括：對(duì)已知產(chǎn)生新骨架細(xì)胞松弛素的活性菌株曲麗穗霉(Spicaria elegans)KLA03，進(jìn)行改變培養(yǎng)條件和加入酶抑制劑的OSMAC(OneStrain-Many Compounds)研究，旨在激活該菌株潛在的沉默代謝途徑獲得多種新類(lèi)似物；同時(shí)從植物內(nèi)生特殊環(huán)境中發(fā)現(xiàn)內(nèi)生菌株

2、，對(duì)其多樣性的次級(jí)代謝產(chǎn)物進(jìn)行了系統(tǒng)研究；并對(duì)獲得的活化合物進(jìn)行抗腫瘤活性評(píng)價(jià)及其構(gòu)效關(guān)系研究。 首先，本實(shí)驗(yàn)室在前期工作中發(fā)現(xiàn)KLA03活性菌株能夠產(chǎn)生系列新骨架開(kāi)鏈細(xì)胞松弛素化合物，該類(lèi)化合物具有顯著的細(xì)胞毒活性和酪氨酸激酶抑制活性，具有抗腫瘤藥物先導(dǎo)結(jié)構(gòu)的優(yōu)勢(shì)。本論文通過(guò)對(duì)改變培養(yǎng)條件和加入酶抑制劑兩個(gè)方面，對(duì)菌株KLA03進(jìn)行了OSMAC研究。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在一種新的豆粉培養(yǎng)基和搖床培養(yǎng)方式下菌株KLA03代謝產(chǎn)物發(fā)生了

3、很大的變化，不再利用苯丙氨酸合成cytochalasins，而是主要利用亮氨酸合成了aspochalasins型的細(xì)胞松弛素(1-17)，其中有9個(gè)是新化合物(1-9)，發(fā)現(xiàn)了同一菌株同時(shí)具有合成cytochalasins和aspochalasins兩種結(jié)構(gòu)類(lèi)型的細(xì)胞松弛素的能力；同時(shí)，在一種高糖培養(yǎng)基中菌株還產(chǎn)生了新的異苯并呋喃二聚體(26和27)和骨架新穎的aspochalasins與異苯并呋喃的混合二聚體(28和29)，通過(guò)推測(cè)它

4、們的可能生合成過(guò)程，提出了aspochalasins類(lèi)化合物的C-19，20位不飽和酮片段發(fā)生自由基加成和Diels-Alder生化反應(yīng)的可能性；加入P450氧化酶抑制劑(美替拉酮)，抑制了cytochalasinsZ7和Z9在生合成過(guò)程中C-6，7為的氧化過(guò)程，生成了新的脫氧的cytochalasins(30和31)。利用X-ray單晶衍射結(jié)合化學(xué)反應(yīng)的方法(Mosher法等)，確定了開(kāi)環(huán)cytochalasins和aspochala

5、sins類(lèi)細(xì)胞松弛素的絕對(duì)構(gòu)型，驗(yàn)證了cytochalasins和aspochalasins在生合成過(guò)程中的同源性。 其次，從不同來(lái)源的紅樹(shù)林樣品中分離純化出內(nèi)生真菌42株，根際土壤真菌96株，通過(guò)以P388細(xì)胞為模型共篩選出活性真菌17株。綜合考慮其活性和代謝產(chǎn)物的HPLC指紋圖譜和TLC分析結(jié)果，最終確定1株產(chǎn)細(xì)胞松弛素的紅樹(shù)林內(nèi)生真菌W-6和另外5株真菌(GQ-7，W-8，JP-1，HK-03-6，HK-16-4)作為進(jìn)一

6、步化學(xué)研究的目標(biāo)菌株。此外，對(duì)2株肉蓯蓉內(nèi)生菌(CF005和AC-6)神經(jīng)保護(hù)活性次級(jí)代謝產(chǎn)物進(jìn)行了系統(tǒng)研究。經(jīng)過(guò)大發(fā)酵，從菌株W-6中分離到12個(gè)化合物，其中包含6個(gè)新的細(xì)胞松弛素(32-37)和2個(gè)新的三肽類(lèi)化合物(38和39)。從另外7株內(nèi)生菌中共分離到化合物78個(gè)，其中新化合物18個(gè)，新化合物類(lèi)型包括6個(gè)tetramic acids(45-50)，1個(gè)橘霉素二聚體(51)，3個(gè)酚醌類(lèi)化合物(59-61)，3個(gè)倍半萜及其衍生物(7

7、4-76)，2個(gè)異苯并呋喃非對(duì)應(yīng)異構(gòu)體(82和83)，和3個(gè)其他類(lèi)化合物(77，95，100)。 以不同腫瘤細(xì)胞株為模型，用SRB法或MTT法對(duì)分離得到的29個(gè)細(xì)胞松弛素類(lèi)化合物的抗腫瘤活性進(jìn)行了評(píng)價(jià)，新發(fā)現(xiàn)了4個(gè)cytochalasins(32，33，35，39)對(duì)A549細(xì)胞具有不同程度的抑制活性，IC50值分別為19.6，5.6，17.4，7.9μM，結(jié)合我們實(shí)驗(yàn)室所分離到的其他結(jié)構(gòu)的Cytochalasins活性評(píng)價(jià)結(jié)果

8、顯示，C-6，7位環(huán)氧結(jié)構(gòu)和C-20位烯醇酯片段是cytochalasins具備高活性的必要的兩個(gè)基團(tuán)。對(duì)于中等活性的cyxochalasins，C-17位的α，β不飽和酮是其活性的關(guān)鍵基團(tuán)，并且苯基部分的羥基取代使其活性降低。全面評(píng)價(jià)了17個(gè)具有亮氨酸殘基的細(xì)胞松弛素(aspochalasins)的細(xì)胞毒活性，充分證明C-19，20位的α，β-不飽和酮片段是該類(lèi)化合物的活性必須基團(tuán)。還評(píng)價(jià)了6個(gè)新的tetramic acids(45-

9、50)對(duì)四種腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒活性，確定了C-8位的飽和脂肪直鏈?zhǔn)腔钚缘年P(guān)鍵基團(tuán)，并且其母核的5S構(gòu)型能夠使其活性明顯增強(qiáng)。發(fā)現(xiàn)化合物59對(duì)P388細(xì)胞具有較強(qiáng)的抑制活性，IC50達(dá)到1.38μM。此外，評(píng)價(jià)了肉蓯蓉內(nèi)生放線菌AC-6的所有代謝產(chǎn)物(108-122)對(duì)GPR12蛋白的親和性，發(fā)現(xiàn)化合物109可能是其配體。還發(fā)現(xiàn)化合物100在0.1nM濃度下對(duì)過(guò)氧化氫損傷的神經(jīng)細(xì)胞具有明顯的保護(hù)性。 總之，本文通過(guò)對(duì)已知菌株KLA0

10、3進(jìn)行OSMAC的研究，和8株植物內(nèi)生菌多樣性次級(jí)代謝產(chǎn)物的研究，共得到122個(gè)化合物單體，其中新化合物42個(gè)，包括19個(gè)新的細(xì)胞松弛素類(lèi)化合物。首次利用培養(yǎng)條件的改變?cè)谕恢昃屑せ盍薬spochalasins和cytochalasins兩種細(xì)胞松弛素的生合成途徑，并通過(guò)對(duì)這兩種細(xì)胞松弛素絕對(duì)構(gòu)型的確定驗(yàn)證了它們生合成過(guò)程中的同源性。評(píng)價(jià)了細(xì)胞松弛素和其它部分新化合物的生物活性。初步闡明了它們的構(gòu)效關(guān)系。既為抗腫瘤新藥提供了新的可能先