真菌次級代謝產(chǎn)物的化學(xué)多樣性開發(fā)及生物活性研究.pdf

1、本文從微生物菌株培養(yǎng)條件多樣性獲得代謝產(chǎn)物多樣性和從不同植物來源的內(nèi)生菌中尋找次級代謝產(chǎn)物多樣性兩方面入手，開展微生物抗腫瘤活性次級代謝產(chǎn)物的研究。研究內(nèi)容包括：對已知產(chǎn)生新骨架細胞松弛素的活性菌株曲麗穗霉(Spicaria elegans)KLA03，進行改變培養(yǎng)條件和加入酶抑制劑的OSMAC(OneStrain-Many Compounds)研究，旨在激活該菌株潛在的沉默代謝途徑獲得多種新類似物；同時從植物內(nèi)生特殊環(huán)境中發(fā)現(xiàn)內(nèi)生菌株

2、，對其多樣性的次級代謝產(chǎn)物進行了系統(tǒng)研究；并對獲得的活化合物進行抗腫瘤活性評價及其構(gòu)效關(guān)系研究。 首先，本實驗室在前期工作中發(fā)現(xiàn)KLA03活性菌株能夠產(chǎn)生系列新骨架開鏈細胞松弛素化合物，該類化合物具有顯著的細胞毒活性和酪氨酸激酶抑制活性，具有抗腫瘤藥物先導(dǎo)結(jié)構(gòu)的優(yōu)勢。本論文通過對改變培養(yǎng)條件和加入酶抑制劑兩個方面，對菌株KLA03進行了OSMAC研究。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在一種新的豆粉培養(yǎng)基和搖床培養(yǎng)方式下菌株KLA03代謝產(chǎn)物發(fā)生了

3、很大的變化，不再利用苯丙氨酸合成cytochalasins，而是主要利用亮氨酸合成了aspochalasins型的細胞松弛素(1-17)，其中有9個是新化合物(1-9)，發(fā)現(xiàn)了同一菌株同時具有合成cytochalasins和aspochalasins兩種結(jié)構(gòu)類型的細胞松弛素的能力；同時，在一種高糖培養(yǎng)基中菌株還產(chǎn)生了新的異苯并呋喃二聚體(26和27)和骨架新穎的aspochalasins與異苯并呋喃的混合二聚體(28和29)，通過推測它

4、們的可能生合成過程，提出了aspochalasins類化合物的C-19，20位不飽和酮片段發(fā)生自由基加成和Diels-Alder生化反應(yīng)的可能性；加入P450氧化酶抑制劑(美替拉酮)，抑制了cytochalasinsZ7和Z9在生合成過程中C-6，7為的氧化過程，生成了新的脫氧的cytochalasins(30和31)。利用X-ray單晶衍射結(jié)合化學(xué)反應(yīng)的方法(Mosher法等)，確定了開環(huán)cytochalasins和aspochala

5、sins類細胞松弛素的絕對構(gòu)型，驗證了cytochalasins和aspochalasins在生合成過程中的同源性。 其次，從不同來源的紅樹林樣品中分離純化出內(nèi)生真菌42株，根際土壤真菌96株，通過以P388細胞為模型共篩選出活性真菌17株。綜合考慮其活性和代謝產(chǎn)物的HPLC指紋圖譜和TLC分析結(jié)果，最終確定1株產(chǎn)細胞松弛素的紅樹林內(nèi)生真菌W-6和另外5株真菌(GQ-7，W-8，JP-1，HK-03-6，HK-16-4)作為進一

6、步化學(xué)研究的目標(biāo)菌株。此外，對2株肉蓯蓉內(nèi)生菌(CF005和AC-6)神經(jīng)保護活性次級代謝產(chǎn)物進行了系統(tǒng)研究。經(jīng)過大發(fā)酵，從菌株W-6中分離到12個化合物，其中包含6個新的細胞松弛素(32-37)和2個新的三肽類化合物(38和39)。從另外7株內(nèi)生菌中共分離到化合物78個，其中新化合物18個，新化合物類型包括6個tetramic acids(45-50)，1個橘霉素二聚體(51)，3個酚醌類化合物(59-61)，3個倍半萜及其衍生物(7

7、4-76)，2個異苯并呋喃非對應(yīng)異構(gòu)體(82和83)，和3個其他類化合物(77，95，100)。 以不同腫瘤細胞株為模型，用SRB法或MTT法對分離得到的29個細胞松弛素類化合物的抗腫瘤活性進行了評價，新發(fā)現(xiàn)了4個cytochalasins(32，33，35，39)對A549細胞具有不同程度的抑制活性，IC50值分別為19.6，5.6，17.4，7.9μM，結(jié)合我們實驗室所分離到的其他結(jié)構(gòu)的Cytochalasins活性評價結(jié)果

8、顯示，C-6，7位環(huán)氧結(jié)構(gòu)和C-20位烯醇酯片段是cytochalasins具備高活性的必要的兩個基團。對于中等活性的cyxochalasins，C-17位的α，β不飽和酮是其活性的關(guān)鍵基團，并且苯基部分的羥基取代使其活性降低。全面評價了17個具有亮氨酸殘基的細胞松弛素(aspochalasins)的細胞毒活性，充分證明C-19，20位的α，β-不飽和酮片段是該類化合物的活性必須基團。還評價了6個新的tetramic acids(45-

9、50)對四種腫瘤細胞的細胞毒活性，確定了C-8位的飽和脂肪直鏈?zhǔn)腔钚缘年P(guān)鍵基團，并且其母核的5S構(gòu)型能夠使其活性明顯增強。發(fā)現(xiàn)化合物59對P388細胞具有較強的抑制活性，IC50達到1.38μM。此外，評價了肉蓯蓉內(nèi)生放線菌AC-6的所有代謝產(chǎn)物(108-122)對GPR12蛋白的親和性，發(fā)現(xiàn)化合物109可能是其配體。還發(fā)現(xiàn)化合物100在0.1nM濃度下對過氧化氫損傷的神經(jīng)細胞具有明顯的保護性。 總之，本文通過對已知菌株KLA0

10、3進行OSMAC的研究，和8株植物內(nèi)生菌多樣性次級代謝產(chǎn)物的研究，共得到122個化合物單體，其中新化合物42個，包括19個新的細胞松弛素類化合物。首次利用培養(yǎng)條件的改變在同一株菌中激活了aspochalasins和cytochalasins兩種細胞松弛素的生合成途徑，并通過對這兩種細胞松弛素絕對構(gòu)型的確定驗證了它們生合成過程中的同源性。評價了細胞松弛素和其它部分新化合物的生物活性。初步闡明了它們的構(gòu)效關(guān)系。既為抗腫瘤新藥提供了新的可能先