三株不同海洋生境來(lái)源真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物及生物活性研究.pdf

1、存在于不同小的生態(tài)環(huán)境中的微生物,由于其生存環(huán)境的差異性、物種競(jìng)爭(zhēng)性以及物種自身受環(huán)境的影響而不斷進(jìn)化,使得同屬或者同種之間的微生物的基因表達(dá)會(huì)產(chǎn)生穩(wěn)定的差異,而這種穩(wěn)定的差異在脫離生存環(huán)境后可能在很長(zhǎng)的時(shí)期內(nèi)還會(huì)保持表達(dá)。因此,不同生境來(lái)源的微生物,在實(shí)驗(yàn)室條件下這種穩(wěn)定的、差異性的表達(dá),其結(jié)果可以產(chǎn)生結(jié)構(gòu)多樣性的次級(jí)代謝產(chǎn)物,為人類發(fā)現(xiàn)新型藥物先導(dǎo)化合物奠定了資源基礎(chǔ)。
　　本課題組通過菌株多級(jí)串聯(lián)篩選技術(shù)已構(gòu)建成不同海洋環(huán)境

2、來(lái)源菌株資源庫(kù),本文建立在該菌株資源庫(kù)的基礎(chǔ)上,選取了3株生存環(huán)境迥異的海洋來(lái)源真菌,開展了系統(tǒng)的次級(jí)代謝產(chǎn)物、生物合成以及生物活性研究。從以下具體內(nèi)容開展研究:運(yùn)用OSMAC策略優(yōu)化培養(yǎng)條件;單體化合物的分離、化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)鑒定以及立體化學(xué)研究;新結(jié)構(gòu)的生物合成研究;單體化合物活性初步評(píng)價(jià),高活性化合物的構(gòu)效關(guān)系探討,分子作用靶點(diǎn)的確定以及分子對(duì)接試驗(yàn)。
　　首先采用 OSMAC策略對(duì)目標(biāo)菌株進(jìn)行發(fā)酵條件的優(yōu)化。實(shí)驗(yàn)表明殼青霉

3、Penicillium crustosum PRB-2對(duì)培養(yǎng)體系敏感,在39種培養(yǎng)條件中確定了最優(yōu)的規(guī)模發(fā)酵條件。球孢枝孢菌Cladosporium sphaerospermum2005-01-E3在大米培養(yǎng)基和豆粉培養(yǎng)基中的代謝產(chǎn)物差別明顯。
　　利用常規(guī)色譜、MPLC、HPLC、手性 HPLC等分離技術(shù)從紅樹林根際環(huán)境來(lái)源雜色曲霉A. versicolor pjx-9發(fā)酵產(chǎn)物中分離得到27個(gè)單體化合物(1-27);從南極深海來(lái)

4、源真菌殼青霉 P. crustosum PRB-2中分離得到36個(gè)單體化合物(28-63);從太平洋深海來(lái)源真菌球孢枝孢菌C. sphaerospermum2005-01-E3中分離得到7個(gè)單體化合物(64-70);共分離得到70個(gè)單體成分。
　　運(yùn)用波譜技術(shù)、X-ray單晶衍射技術(shù)、ECD技術(shù)(比較ECD和ECD計(jì)算)、化學(xué)轉(zhuǎn)化溝通、mosher′s法、marfey實(shí)驗(yàn)、質(zhì)譜以及物理性質(zhì)等鑒定技術(shù)闡明了全部70個(gè)單體化合物的結(jié)構(gòu)

5、,結(jié)構(gòu)類型包括二聚xanthone類結(jié)構(gòu)15個(gè)(1-15),蒽醌類4個(gè)(16-19),甾醇類2個(gè)(22-23),含clavatol類的結(jié)構(gòu)16個(gè)(28-43),生物堿類20個(gè)(20-21,24-25,55-70),苯衍生物以及其他類13個(gè)(26-27,44-54)。其中發(fā)現(xiàn)新化合物33個(gè),包括13個(gè)由多種單體和2-2′、罕見的2-4′和4-4′等不同連接方式組合構(gòu)建的、新穎且具有復(fù)雜立體化學(xué)的二聚xanthone類結(jié)構(gòu)(1-12,15)

6、;2個(gè)含有新穎的、高度氧化的3,3a,9,9a-tetrahydro-1H-furo[3,4-b]chromen-1-one碳骨架結(jié)構(gòu)(28,29);2個(gè)含有互變特性6a-hydroxy-6,6a,12,12a-tetrahydro-5H-benzo[a]xanthen-5-one新骨架化合物(42,43);5個(gè)具有monoclavatolα-furanone新結(jié)構(gòu)類型的化合物(31-34,36);2個(gè)具有monoclavatolα-p

7、yranone新結(jié)構(gòu)類型的化合物(38,39);1個(gè)新的環(huán)氧開環(huán)的苯二氮卓類結(jié)構(gòu)(55);一類新穎的、結(jié)構(gòu)互變的且含有未見報(bào)道的6(3)-enamino-8,10-dihydroxy或6(3)-enamino-7(8)-en-10-ol側(cè)鏈的tetramic acid類衍生物(64-67,69-70)以及1個(gè)生物合成相關(guān)產(chǎn)物(68);此外還發(fā)現(xiàn)3個(gè)新天然產(chǎn)物(14,44-45)。首次運(yùn)用X-ray單晶衍射技術(shù)、ECD電子圓二色譜等多種技

8、術(shù)解決了二聚xanthone類結(jié)構(gòu)(1-15)中存在的具有挑戰(zhàn)性的絕對(duì)構(gòu)型問題;運(yùn)用X-ray單晶衍射技術(shù)、ECD電子圓二色譜法以及物理性質(zhì)確定了新骨架penilactones A和B(28,29)具有正相反絕對(duì)構(gòu)型以及monoclavatolα-furanone類(30-36)的絕對(duì)構(gòu)型;正在采用HPLC-ECD實(shí)驗(yàn)以及ECD計(jì)算等技術(shù)確定立體結(jié)構(gòu)互變的、新穎骨架42的絕對(duì)構(gòu)型;利用丙叉化實(shí)驗(yàn),Mosher’s法以及耦合常數(shù)確定了新穎

9、的tetramic acid類產(chǎn)物64-67,69-70的相對(duì)構(gòu)型和絕對(duì)構(gòu)型,并闡明了互變作用機(jī)制;采用Marfey實(shí)驗(yàn)確定了68中氨基酸的構(gòu)型。
　　生物合成研究方面,采用13C同位素飼喂實(shí)驗(yàn)證實(shí)了新骨架 penilactone A(28)和生物合成相關(guān)產(chǎn)物35是由混源的PKS和TCA循環(huán)途徑產(chǎn)生,代表了一類自然界中非常少見的以這兩種混源途徑產(chǎn)生的化合物;38則證實(shí)是由 PKS途徑產(chǎn)生。通過考察產(chǎn)物產(chǎn)生時(shí)間順序、發(fā)酵液pH變化、

10、化合物穩(wěn)定等實(shí)驗(yàn)表明化合物13在發(fā)酵初期可能轉(zhuǎn)化成了酸穩(wěn)定的Secalonic acid D(SAD,14),而SAD在整個(gè)發(fā)酵過程中很可能穩(wěn)定的存在。
　　生物活性方面,采用MTT法和SRB法對(duì)單體化合物進(jìn)行活性初步評(píng)價(jià),化合物2,5,6,8,9,12-14對(duì)7株腫瘤細(xì)胞株顯示出顯著的、廣譜的增殖抑制活性,IC50在0.4-10μM之間,并初步探討了這類結(jié)構(gòu)的構(gòu)效關(guān)系。其中阻轉(zhuǎn)異構(gòu)體8和9對(duì)腫瘤細(xì)胞株表現(xiàn)出選擇增殖抑制活性,化合

11、物8對(duì)胃癌細(xì)胞株MGC803的增殖抑制活性最好(IC50為4.6μM),對(duì)正常人胚腎細(xì)胞HEK293的IC50大于50μM。DNA Topo I松弛活性實(shí)驗(yàn)證實(shí)拓?fù)洚悩?gòu)酶I(Topo I)是高活性化合物2,8,9的活性作用靶點(diǎn)之一,且阻轉(zhuǎn)異構(gòu)體8的Topo I抑制活性強(qiáng)于9?；衔?的抗腫瘤活性作用機(jī)制在進(jìn)行中。此外,化合物42和43表現(xiàn)出對(duì)胃癌細(xì)胞株MGC803以及HL-60中等細(xì)胞毒活性?；衔?6顯示出了中等的抗A H1N1病毒的

12、活性。
　　本文闡明了3株海洋來(lái)源真菌中70個(gè)次級(jí)代謝產(chǎn)物的化學(xué)結(jié)構(gòu),其中新化合物33個(gè)和新天然產(chǎn)物3個(gè);發(fā)現(xiàn)一類結(jié)構(gòu)多樣、抗腫瘤活性顯著、結(jié)構(gòu)新穎的二聚xanthone類化合物,2類新骨架結(jié)構(gòu)(新骨架28被NPR評(píng)為“熱點(diǎn)化合物”)和一類新穎的tetramic acid類衍生物,并采用多種技術(shù)手段確定了這些結(jié)構(gòu)新穎化合物的絕對(duì)構(gòu)型。根據(jù)二聚xanthone結(jié)構(gòu)的產(chǎn)生的時(shí)間和模擬pH實(shí)驗(yàn)初步討論了這類結(jié)構(gòu)的生物合成過程;13C同位