鉛對(duì)神經(jīng)細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路中蛋白激酶C及鈣調(diào)蛋白表達(dá)影響的研究.pdf

1、目的：研究鉛對(duì)仔鼠海馬、人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251中的蛋白激酶C(PKC)、鈣調(diào)蛋白(CaM)的mRNA和蛋白表達(dá)的影響，以進(jìn)一步探討鉛神經(jīng)毒作用的分子機(jī)制，為鉛中毒的防治工作提供理論依據(jù)。 方法：1.鉛對(duì)仔鼠的學(xué)習(xí)記憶能力及相關(guān)指標(biāo)的影響將孕鼠隨機(jī)分為去離子水對(duì)照組、0.2％醋酸鉛(Pb(Ac)2)和1％Pb(Ac)2組，從懷孕第0d起開始通過自由飲水染毒。幼鼠出生后，先通過哺乳接觸鉛，斷乳后則自行飲用與其母鼠濃度相同的含鉛水。出

2、生后(postnatal，PN)8d內(nèi)行懸崖回避實(shí)驗(yàn)，PN50d行跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)，隨后處死仔鼠，原子吸收光譜法測(cè)定腦鉛含量，乙酰膽堿酯酯酶試劑盒測(cè)定乙酰膽堿酯酶活力，RT-PCR法和Western-blotting法觀察各組仔鼠海馬PKC、CaM的mRNA和蛋白表達(dá)情況；2.鉛對(duì)人神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞U251細(xì)胞PKC、CaM表達(dá)的影響將U251細(xì)胞分為5×10-8、5×10-6、5×10-4mol/LPb(Ac)2染毒組和生理鹽水對(duì)照組，接種

3、密度為5.5×105個(gè)/ml，75cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶每瓶接種5ml，培養(yǎng)24h貼壁后染毒，染毒24h。MTT實(shí)驗(yàn)觀察鉛對(duì)U251細(xì)胞存活率的影響，免疫細(xì)胞化學(xué)觀察PKC和CaM在細(xì)胞中的定性表達(dá)，RT-PCR和Westernblot方法檢測(cè)各組細(xì)胞中PKC和CaM的mRNA和蛋白表達(dá)水平。 結(jié)果：1.鉛對(duì)仔鼠的學(xué)習(xí)記憶能力及相關(guān)指標(biāo)的影響：(1)染鉛組仔鼠的體重、身長均低于對(duì)照組(P<0.01)，且呈劑量反應(yīng)關(guān)系。(2)染鉛組PN

4、8d和PN50d的仔鼠腦鉛含量均高于對(duì)照組(P<0.01)，呈劑量反應(yīng)關(guān)系；同劑量組PN50d與PN8d的仔鼠相比，腦鉛含量明顯增加(P<0.01)。(3)染鉛組平面翻正反射完成率均低于對(duì)照組(P<0.01)，1％Pb(Ac)2組平面翻正反射完成率低于0.2％Pb(Ac)2組(P<0.01)。(4)染鉛組懸崖回避完成率均低于對(duì)照組(P<0.01)。1％Pb(Ac)2組懸崖回避完成率低于0.2％Pb(Ac)2組(P<0.01)。(5)鉛可

5、顯著降低仔鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，染鉛組仔鼠跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)反應(yīng)時(shí)間延長、潛伏期變短、錯(cuò)誤次數(shù)顯著高于對(duì)照組(P<0.05，P<0.01)，且呈劑量反應(yīng)關(guān)系。(6)PN8d1％Pb(Ac)2組仔鼠海馬的膽堿酯酶活力低于對(duì)照組(P<0.01)；PN50d的0.2％、1％Pb(Ac)2組仔鼠海馬的膽堿酯酶活力均低于對(duì)照組(P<0.05，P<0.01)，且呈劑量反應(yīng)關(guān)系。(7)PN8d和PN50d的1％Pb(Ac)2組仔鼠海馬的PKCmRNA相對(duì)表達(dá)量均低

6、于對(duì)照組(P<0.05，P<0.01)，0.2％Pb(Ac)2組仔鼠海馬的PKCmRNA相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照組比較差異均沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。PN50d與PN8d相比，1％Pb(Ac)2組PKCmRNA表達(dá)有下降趨勢(shì)，但差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。(8)PN8d和PN50d的0.2％、1％Pb(Ac)2組仔鼠海馬PKC蛋白相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照組比較表達(dá)均降低(P<0.01)，且呈劑量反應(yīng)關(guān)系。PN50d與PN8d相比，1％Pb

7、(Ac)2組PKC蛋白表達(dá)有下降趨勢(shì)，但差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。(9)PN8d的1％Pb(Ac)2組仔鼠海馬CaMmRNA相對(duì)表達(dá)量低于對(duì)照組(P<0.05)，但0.2％Pb(Ac)2組與對(duì)照組比較差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；PN50d的0.2％和1％Pb(Ac)2組仔鼠海馬CaMmRNA表達(dá)均低于對(duì)照組(P<0.05，P<0.01)，且呈劑量反應(yīng)關(guān)系。PN50d與PN8d相比，1％Pb(Ac)2組CaMmRNA表達(dá)

8、有下降趨勢(shì)，但差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。(10)PN8d1％Pb(Ac)2組仔鼠海馬CaM蛋白相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照組比較表達(dá)降低(P<0.01)，而0.2％Pb(Ac)2組與對(duì)照組比較差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；PN50d的0.2％、1％Pb(Ac)2組仔鼠海馬CaM蛋白相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照組比較均降低(P<0.05，P<0.01)，呈劑量反應(yīng)關(guān)系。PN50d與PN8d相比，0.2％、1％Pb(Ac)2組CaM蛋白表達(dá)均有下降

9、趨勢(shì)，但差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；2.鉛對(duì)U251細(xì)胞中PKC、CaM表達(dá)的影響：(1)5×10-6、5×10-5和5×10-4mol/LPb(Ac)2組的細(xì)胞存活率與對(duì)照組相比均降低(P<0.01)，且隨劑量的增加存活率下降。(2)細(xì)胞免疫化學(xué)結(jié)果顯示，PKC、CaM在U251細(xì)胞的胞質(zhì)中均有表達(dá)。且隨劑量的增加，陽性表達(dá)細(xì)胞率均下降。(3)5×10-4mol/LPb(Ac)2組PKCmRNA相對(duì)表達(dá)量低于對(duì)照組(P<0.0

10、5)；而5×10-8、5×10-6Pb(Ac)2組PKCmRNA相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照組比較沒有減少(P>0.05)。5×10-8、5×10-6、5×10-4mol/LPb(Ac)2組PKC蛋白相對(duì)表達(dá)量均低于對(duì)照組(P<0.01)，且隨劑量的增加蛋白表達(dá)降低。(4)5×10-8、5×10-6、5×10-4Pb(Ac)2組的CaMmRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量均低于對(duì)照組(P<0.01)，且呈劑量反應(yīng)關(guān)系。 結(jié)論：1.通過孕期和哺乳期對(duì)母鼠

11、染毒，鉛可以在仔鼠的腦部蓄積；使仔鼠的學(xué)習(xí)記憶能力下降；降低膽堿酯酶的活力；使不同發(fā)育時(shí)期的仔鼠海馬部位的PKC、CaM的mRNA和蛋白表達(dá)均降低，可能是鉛影響仔鼠學(xué)習(xí)記憶能力的機(jī)制之一；2.鉛可以影響U251細(xì)胞的生長，使細(xì)胞存活率下降；使U251細(xì)胞中的PKC、CaM的mRNA和蛋白表達(dá)均降低，可能是鉛對(duì)人體的神經(jīng)毒性的機(jī)制之一。綜上，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)與細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果一致。提示鉛對(duì)信號(hào)傳導(dǎo)通路中PKC、CaM的影響可能是其神經(jīng)毒性的機(jī)制之