鈉鉀泵參與5-羥色胺對大鼠海馬CA1區(qū)NMDA電流的調(diào)節(jié).pdf

1、本實驗擬采用大鼠腦片采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)，以NMDA電流和Na+-K+泵電流為指標(biāo)，觀察5-HT和Na+-K+泵對海馬CA1區(qū)神經(jīng)元NMDA電流的影響和5-HT對大鼠海馬CAl區(qū)神經(jīng)元Na+-K+泵電流的影響，以探討5-HT對學(xué)習(xí)與記憶功能的調(diào)節(jié)及其機制。
　　 第一部分5-羥色胺與鈉鉀泵對大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元NMDA電流的調(diào)節(jié)目的：本研究旨在觀察5-羥色胺和Na+-K+泵對海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元NMDA電流的影響，并進一步探

2、討相應(yīng)機制。
　　 方法：（1）取出生2周SD大鼠快速斷頭取腦，置于預(yù)先氧飽和（95％O2+5％CO2）的4℃人工腦脊液（artificialcerebrospinalfluid，ASCF）中，將其按冠狀切面用氰丙烯酸鹽膠粘在切片機的標(biāo)本托上，用4℃ACSF浸埋（保持腦組織在低溫狀態(tài)下，以減小由于缺氧而引起的損傷），并持續(xù)通氣（95％O2+5％CO2）。在4℃氧飽和條件下，用振動切片機切成300μm厚的切片，將切片移至孵育槽內(nèi)，

3、持續(xù)通以95％O2和5％CO2，30-32℃孵育1小時。（2）全細(xì)胞膜片鉗方法記錄NMDA電流：將孵育好的腦片放置于灌流槽中，持續(xù)灌流用95％O2和5％CO2飽和的ASCF，流速約為3ml/min，使腦片浸沒于液面下約3～4mm。利用紅外微分干涉相差顯微鏡，通過圖像采集軟件觀察并選擇合適的神經(jīng)元使其成像于計算機監(jiān)視器屏幕上。然后通過微電極操縱器引導(dǎo)電極到達(dá)記錄部位，形成高阻抗（>1GΩ）封接，再繼續(xù)施以負(fù)壓吸破細(xì)胞膜，形成whole-c

4、ell記錄模式，鉗制電壓設(shè)置為-60mV。當(dāng)細(xì)胞膜電流穩(wěn)定之后，將灌流液體切換成含有NMDA（此為NMDA受體的特異性激動劑）的ACSF，可記錄到膜電流的內(nèi)向移動變化，此NMDA引起的膜電流內(nèi)向移動的變化幅度即為NMDA電流（INM）。（3）雙氫哇巴因（dihydroouabain，DHO）對INM影響的測定：實驗采用自身對照的方法，即在同一細(xì)胞上先測定INM幅度作為對照，然后再測定不同濃度DHO干預(yù)時的INM幅度，并以對照電流值標(biāo)化給

5、藥后的電流值求得均數(shù)。（4）5-HT對INM影響的測定：方法同（3）。
　　 結(jié)果：（1）若以對照INM作為100％，DHO（10-5，104，10-3M）能劑量依賴性地增強INM，并使其分別增強至146.25±10.34％，195.78±8.94％和154.75±14.18％（P<0.01或0.05），其中DHO10-4M增強INM作用最大。（2）在H89（PKA特異性抑制劑）存在的情況下，DHO增強INM的效應(yīng)分別為202.

6、28±23.28％和175.86±26％，無明顯改變（P>0.05）。在十字孢堿（staurosporine，Stau，PKC特異性抑制劑）存在的情況下，DH0增強INM的效應(yīng)分別為187.46±27.57％和178.32±34.3％，也無明顯改變（P>0.05）。H89和Stau本身對INM無明顯影響，H89為101.7±11.3％，Stau為108.92±10.77％，（P>0.05）。提示PKA和PKC信號通路不參與介導(dǎo)DHO增強

7、INM的效應(yīng)。（3）在PP2（Src特異性抑制劑）存在的情況下，DHO增強INM的效應(yīng)由173±25.66％顯著降低到106.8±5.92％（P<0.05）。在PD-98059（MAPK特異性抑制劑）存在的情況下，DHO增強INM的效應(yīng)也部分被阻斷，由210±28.11％降低到135.25±15.60％（P<0.05）。而PP2和PD-98059本身則對INM無明顯影響，其中PP2為94.4±12.58％，PD-98059為120.25

8、±12.09％，（P>0.05）。提示Src和MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路介導(dǎo)DHO增強INM的效應(yīng)。（4）5-羥色胺0.01，0.1和1mM可濃度依賴性增強INM，使其分別增強至109.4±4.96％（P>0.05），146.4±13.48％和161.83±13.06％（P<0.05），但5-羥色胺0.01mM對INM的影響無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 小結(jié)：DHO可通過Src和MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路濃度依賴性增強大鼠海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元NM

9、DA電流，5-羥色胺也可濃度依賴性增強海馬NMDA電流，提示Na+-K+泵和5-羥色胺都可能參與海馬NMDA受體對學(xué)習(xí)記憶的調(diào)節(jié)。
　　 第二部分5-羥色胺對大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元Na+-K+泵電流的調(diào)節(jié)目的：研究5-羥色胺對大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元Na+-K+泵電流的影響，并進一步探討可能參與這一調(diào)節(jié)過程的5-羥色胺受體途徑。
　　 方法：（1）斷頭取海馬腦片：同第一部分。（2）以全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄Na+-K+泵電流（

10、IP）：將制備好的海馬腦片放置于灌流槽中，持續(xù)灌流95％O2和5％CO2飽和的ASCF，使腦片浸沒于液面下。為了消除鉀離子、鈣離子、鈉離子對記錄電流的干擾，整個實驗過程中，鉗制電壓設(shè)定為-60mV，在這一電壓下，電壓依賴性Na+和Ca+通道都處于失活狀態(tài)下。另外，在電極內(nèi)液中加入了TEACL，以阻斷K+電流；在細(xì)胞外液中加入了BaCl2、CdCl2、TTX，來分別阻斷K+電流、Ca2+電流和Na+電流，從而排除了其它通道電流的影響。在紅

11、外微分干涉相差顯微鏡下，移動電極至細(xì)胞上方負(fù)壓吸引形成封接，再以負(fù)壓吸破細(xì)胞膜，測定該細(xì)胞的電容，然后至少穩(wěn)定5min使電極內(nèi)液與細(xì)胞內(nèi)液充分交換，并將細(xì)胞鉗制在-60mV，當(dāng)膜電流穩(wěn)定時，換為含0.5mM毒毛旋花子甙（strophanthin，Str）的灌流液，以全細(xì)胞膜片鉗方式記錄海馬神經(jīng)元的IP（EPC-10，HekaInstruments），并以電流/電容求得該細(xì)胞IP的電流密度。（3）5-羥色胺對IP的影響：破膜后至少穩(wěn)定5m

12、in使得電極內(nèi)液和細(xì)胞內(nèi)液充分交換，首先灌流不同濃度的5-羥色胺（0.01-1mM）3-4min，待5-羥色胺引起的膜電流移動不再變化時（表示5-羥色胺作用已經(jīng)穩(wěn)定），再用含有相應(yīng)濃度5-羥色胺和0.5mM毒毛旋花子甙的ASCF灌流細(xì)胞，測定5-羥色胺干預(yù)后的IP，并以電流/電容求得該細(xì)胞IP的電流密度。（4）影響IP的5-羥色胺受體鑒別：在特異性5-HT1AR與5-HT3R拮抗劑（WAY100635和ondasetron）存在的情況下

13、，分別重復(fù)上述（2）和（3）的實驗程序，以鑒別可能參與這一調(diào)節(jié)作用的5-羥色胺受體亞型。
　　 結(jié)果：（1）對照組IP的電流密度為0.64：±0.04pA/pF，5-羥色胺0.1和1mM可顯著抑制IP，使其電流密度分別降低至0.39±0.05和0.35±0.04pA/pF（P<0.01）；（2）在有無WAY100635（5-HT1AR拮抗劑，10μM）存在的情況下，5-羥色胺介導(dǎo)的IP密度分別為0.38±0.07pA/pF和0.

14、39±0.05pA/pF，無明顯改變（P>0.05）；（3）5-HT3R拮抗劑ondasetron10μM可使5-羥色胺介導(dǎo)的IP密度由0.39±0.05pA/pF顯著升高至0.59±0.05pA/pF（P<0.05）。而WAY100635和ondasetron本身對IP均無明顯影響（P>0.05）。提示5-羥色胺介導(dǎo)的IP抑制可被ondasetron阻斷，而不能被WAY100635阻斷；（4）同樣，1-（3-Chlorophenyl）

15、biguanidehydrochloride（m-CPBG，5-HT3R激動劑，0.1mM）能模擬5-羥色胺（0.1mM）對IP的抑制，使其電流密度由0.64±0.04pA/pF顯著降低至0.41±0.05pA/pF（P<0.01）。這些結(jié)果均表明5-羥色胺介導(dǎo)的IP抑制可能由5-HT3R介導(dǎo)，而與5-HT1AR無關(guān)。
　　 小結(jié)：5-羥色胺可通過激活5-HT3R濃度依賴性抑制大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的Na+-K+泵電流，提示Na

16、+-K+泵可能參與5-羥色胺對海馬NMDA受體的調(diào)節(jié)，從而可能參與對學(xué)習(xí)記憶的調(diào)節(jié)。
　　 結(jié)論
　　 1.DHO可通過Src和MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路濃度依賴性增強大鼠海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元NMDA電流，5-羥色胺也可濃度依賴性增強海馬NMDA電流，提示Na+-K+泵和5-羥色胺都可能參與海馬NMDA受體對學(xué)習(xí)記憶的調(diào)節(jié)。
　　 2.5-羥色胺可通過激活5-HT3R濃度依賴性抑制大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的Na+-K+