藥用植物肖菝葜的內(nèi)生真菌生物多樣性研究.pdf

1、內(nèi)生菌是其生活史中的某一段時(shí)期或全部時(shí)期無(wú)癥狀地生活在植物組織內(nèi)的真菌或細(xì)菌。近二十年來(lái)，人們開(kāi)始關(guān)注并進(jìn)行內(nèi)生真菌的研究。從目前已經(jīng)研究過(guò)的植物來(lái)看，內(nèi)生真菌在植物中普遍存在，二者在協(xié)調(diào)進(jìn)化過(guò)程中形成了互惠共生關(guān)系。內(nèi)生真菌一方面可以從宿主中吸收營(yíng)養(yǎng)供自己生長(zhǎng)需要，一方面在宿主的生長(zhǎng)發(fā)育和系統(tǒng)演化過(guò)程中起重要作用如：增強(qiáng)宿主的生長(zhǎng)、抗干旱能力、抗病蟲(chóng)害能力、產(chǎn)生有生理活性的代謝物質(zhì)等。內(nèi)生真菌在生態(tài)環(huán)境中扮演的眾多角色，尚待發(fā)掘的豐富

2、資源和具有藥用價(jià)值生理活性代謝物，構(gòu)成內(nèi)生真菌研究的巨大動(dòng)力。但相對(duì)于其他真菌類群的研究來(lái)說(shuō)，我們對(duì)內(nèi)生真菌的認(rèn)識(shí)還很膚淺，絕大部分植物內(nèi)生真菌群落仍然是未知的。 內(nèi)生真菌能產(chǎn)生與宿主相同或相似的具有生理活性的代謝產(chǎn)物，利用能產(chǎn)生生理活性物質(zhì)的內(nèi)生真菌發(fā)酵生產(chǎn)治療疾病的藥物，可以節(jié)約天然植物資源和保護(hù)生態(tài)環(huán)境。藥用植物肖菝葜，為菝葜科肖菝葜屬常用中草藥，其干燥根莖或者整個(gè)植株被稱為“白土茯苓”入藥，具有利尿，除濕，解毒，通利關(guān)節(jié)

3、等功能。肖菝葜內(nèi)生真菌是否可以產(chǎn)生有生理活性的次生代謝產(chǎn)物呢?關(guān)于肖菝葜內(nèi)生真菌的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本文利用分子生物學(xué)技術(shù)研究藥用植物肖菝葜內(nèi)生真菌生物多樣性，旨在為探索肖菝葜內(nèi)生真菌的巨大潛在應(yīng)用價(jià)值提供基礎(chǔ)研究。 本論文采用光鏡觀察和分子生物學(xué)技術(shù)，對(duì)肖菝葜春季和夏季莖組織內(nèi)生真菌多樣性進(jìn)行研究。作者用苯胺藍(lán)染色光鏡觀察法直接觀察在肖菝葜莖組織內(nèi)部?jī)?nèi)生真菌的分布情況。肖菝葜莖組織是柱狀體，橫切面近似圓形，皮層細(xì)胞內(nèi)散布著被苯胺

4、藍(lán)染色的真菌菌絲。夏季采集的樣品在皮層細(xì)胞的第2-3層散布，而春季采集的樣品在皮層細(xì)胞的第5-6層致密分布。通過(guò)直接觀察分析，春季肖菝葜莖組織內(nèi)生真菌較夏季豐富。 為了考察內(nèi)生真菌群落構(gòu)成，分別提取春、夏兩季莖組織的總DNA，利用真核生物通用引物L(fēng)H2/Sm73選擇性擴(kuò)增核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(rDNAITS區(qū))片段，結(jié)果表明，LH2/Sm73成功地同時(shí)擴(kuò)增出植物和真菌rDNAITS目的片斷。PCR產(chǎn)物經(jīng)割膠純化，分別構(gòu)建春、夏兩季莖

5、組織內(nèi)生真菌以及植物ITS區(qū)序列的克隆文庫(kù)。真菌文庫(kù)分別隨機(jī)篩選150個(gè)克隆子，植物文庫(kù)篩選19個(gè)陽(yáng)性克隆子。對(duì)陽(yáng)性克隆子的插入片段進(jìn)行限制性內(nèi)切酶酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)分析，對(duì)每一種RFLP型的克隆子進(jìn)行序列測(cè)定和生物多樣性分析。結(jié)果表明：植物rDNAITS文庫(kù)的陽(yáng)性克隆子RFLP型具有同質(zhì)性，經(jīng)測(cè)序分析為植物rDNAITS區(qū)序列。夏季肖菝葜文庫(kù)(XJB)篩選的14個(gè)RFLP型全部被春季肖菝葜文庫(kù)(YJ4)篩選出的44個(gè)RFL

6、P型覆蓋，表明春季肖菝葜莖組織內(nèi)生真菌群落較夏季更為豐富。 從YJ4文庫(kù)的每種RFLP型中隨機(jī)挑選不少于兩個(gè)克隆子，其質(zhì)粒DNA用載體通用引物P47或P48進(jìn)行序列測(cè)定。使用Blastn程序，對(duì)測(cè)定的序列與國(guó)際基因數(shù)據(jù)庫(kù)GenBank和EMBL中的相關(guān)序列進(jìn)行同源性分析，這49條序列可以歸入真菌域。在49個(gè)真菌rDNAITS區(qū)序列中只有YJ4-Ⅲ4，與擔(dān)子菌同源性較高，其余48條rDNAITS區(qū)序列，與子囊菌同源性高。49個(gè)真菌

7、序列中，有12個(gè)序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中最近源序列相似率在99％以上，其中YJ4-1，YJ4-26和YJ4-46與其最近源序列相似率為100％；有9個(gè)序列與近源序列相似率在90％到98％之間；有13個(gè)序列與近源序列相似率在75％到90％之間；有15個(gè)序列與已知的ITSrDNA序列相似率在75％以下，其中YJ4-93與近源序列相似率為47.0％。 生物多樣性分析表明內(nèi)生真菌主要的群落構(gòu)成為：球腔菌屬(Mycosphaerell

8、a)，擬莖點(diǎn)霉屬(Phomopsis)，小叢殼屬(Glomerella)，短梗霉屬(Aureobasidium)，枝孢屬(Cladosporium)，殼梭孢屬(Fusicoccum)，球座菌屬(Guignardia)，葡萄座腔菌科(Botryosphaeriaceae)和銹菌綱(Urediniomycetes)。其中球腔菌屬(Mycosphaerella)，擬莖點(diǎn)霉屬(Phomopsis)，小叢殼屬(Glomerella)和短梗霉屬(A

9、ureobasidium)為主要優(yōu)勢(shì)類群。還有幾個(gè)序列，如YJ4-61，與基因數(shù)據(jù)庫(kù)內(nèi)的序列同源性非常低；有些序列，如YJ4-9和YJ4-70與環(huán)境樣本的序列相似率很高。 本研究首次通過(guò)肖菝葜莖組織rDNAITS文庫(kù)的構(gòu)建和分析，綜合運(yùn)用分子生物學(xué)、生物信息學(xué)和分子系統(tǒng)學(xué)的方法，探討肖菝葜莖組織內(nèi)生真菌生物多樣性，并深入比較分析春、夏兩季肖菝葜內(nèi)生真菌群落結(jié)構(gòu)差異。揭示了肖菝葜內(nèi)生真菌群落構(gòu)成具有十分豐富的多樣性，且其構(gòu)成與豐度