豬苓多糖協(xié)同卡介苗誘導(dǎo)小鼠免疫應(yīng)答啟動(dòng)機(jī)制的研究.pdf

1、[目的]： 1．研究豬苓多糖(polyporus polysaccharide，PPS)協(xié)同卡介苗(bacilluscalmette guerin，BCG)誘導(dǎo)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞TLR2、TLR4、CD14、黏附分子及共刺激分子的表達(dá)，核轉(zhuǎn)錄因子NF-кB的激活，炎癥因子的表達(dá)，探討其誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答啟動(dòng)機(jī)制。 2．研究卡介苗在人膀胱癌細(xì)胞株T24中的直接作用部位和對(duì)T24超微結(jié)構(gòu)的影響，及豬苓多糖對(duì)其的協(xié)同作用。

2、[方法]： 1．實(shí)驗(yàn)分組，每組18只NIH小鼠(26-28g)：①對(duì)照組(皮下注射生理鹽水0.1ml/只)②BCG組(皮下注射BCG懸液lmg/只)③B+P組(BCG給藥同前，同時(shí)腹腔注射PPS 2mg/只，)④PPS組(腹腔注射PPS 2mg/只)。分別在給藥后2小時(shí)，12小時(shí)，24小時(shí)從每組各抽取6只小鼠，處死后收集小鼠腹腔巨噬細(xì)胞。 2．應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)觀察PPS、BCG刺激后小鼠腹腔巨噬細(xì)胞TLR2，TLR4，CD

3、14，CD11b，CD40的表達(dá)情況。 3．用間接熒光法對(duì)PPS、BCG免疫后的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞進(jìn)行染色，利用激光共聚焦顯微鏡技術(shù)，觀察核轉(zhuǎn)錄因子NF-кB分子，在胞漿和胞核表達(dá)的變化以及其轉(zhuǎn)移的情況。 4．運(yùn)用ELISA技術(shù)，檢測(cè)PPS、BCG免疫后的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞上清液中IL-1β、IL-12和IL-10，脾臟勻漿液中IL-2和IL-4及外周血清TNF-α的含量。 5．用透射電鏡和掃描電鏡技術(shù)觀察BCG在T

4、24中的作用部位，對(duì)T24超微結(jié)構(gòu)的影響，及PPS的協(xié)同作用。 6．實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用PEMS 3.0統(tǒng)計(jì)分析軟件分別進(jìn)行多個(gè)均數(shù)比較分析。 [結(jié)果]： 1．PPS協(xié)同BCG體內(nèi)刺激對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞TLRs表達(dá)的影響：(1)PPS組12h巨噬細(xì)胞TLR2表達(dá)高于對(duì)照組(P<0.05)，24h后下降。B+P組2h后TLR2表達(dá)高于PPS和BCG單用組(P<0.05)，12h之后下降。(2)PPS組小鼠巨噬細(xì)胞TLR4表

5、達(dá)在3個(gè)時(shí)點(diǎn)無(wú)明顯變化，在12h、24h低于對(duì)照組(P<0.05)。B+P組2h后TLR4表達(dá)高于PPS和BCG單用組(P<0.05)。(3)PPS組小鼠巨噬細(xì)胞CD14表達(dá)在3個(gè)時(shí)點(diǎn)無(wú)明顯變化，在12h、24h低于對(duì)照組(P<0.05)。B+P組2h后CD14表達(dá)高于PPS和BCG單用組(P<0.05)，之后下降。 2．PPS協(xié)同BCG體內(nèi)刺激對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞共刺激分子表達(dá)的影響：(1)PPS組12h小鼠巨噬細(xì)胞CD11b表

6、達(dá)高于對(duì)照組(P<0.05)，24h后下降。B+P組2h和12h CD11b表達(dá)高于PPS和BCG單用組(P<0.05)，之后下降。 (2)PPS組小鼠巨噬細(xì)胞CD40表達(dá)在3個(gè)時(shí)點(diǎn)無(wú)明顯變化，在2h、12h低于對(duì)照組(P<0.05)。B+P組2h后CD40表達(dá)高于PPS(P<0.05)。 3．PPS協(xié)同BCG體內(nèi)刺激對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞NF-кB活化的影響：(1)PPS組NF-кB胞核熒光強(qiáng)度在3個(gè)時(shí)點(diǎn)內(nèi)緩慢上升，但均低

7、于對(duì)照組(P<0.05)；B+P組NF-кB胞核熒光強(qiáng)度高于PPS組(P<0.05)，在12h明顯增強(qiáng)，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(2)PPS組NF-кB胞漿熒光強(qiáng)度在3個(gè)時(shí)點(diǎn)呈上升趨勢(shì)，但均低于對(duì)照組(P<0.05)；B+P組NF-кB胞漿熒光強(qiáng)度在2h和12h高于PPS組(P<0.05)，在12h明顯增強(qiáng)。(3)PPS組NF-кB核漿熒光強(qiáng)度比在3個(gè)時(shí)點(diǎn)呈下降趨勢(shì)，24h低于對(duì)照(P<0.05)；B+P組NF-кB核漿熒光強(qiáng)度比

8、在24h明顯上升，高于PPS組和對(duì)照組(P<0.05)。 4．PPS協(xié)同BCG體內(nèi)刺激對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞細(xì)胞因子分泌的影響：(1)PPS組2h小鼠腹腔巨噬細(xì)胞IL-1β分泌高于對(duì)照組(P<0.05)，B+P組IL-1β分泌低于PPS組，在2h和24h有統(tǒng)計(jì)意義(P<0.05)。(2)PPS組小鼠脾勻漿上清中IL-4含量在3個(gè)時(shí)點(diǎn)變化不明顯，低于對(duì)照組，但無(wú)統(tǒng)計(jì)意義。B+P組IL-4含量與PPS組相近，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)意義。(3)小鼠腹

9、腔巨噬細(xì)胞上清中未檢測(cè)到IL-12，IL-10和脾勻漿液中的IL-2，外周血清的TNF-α。 5．BCG對(duì)T24的直接作用及形態(tài)學(xué)觀察： BCG組2h細(xì)胞表面球狀顆粒增多，胞膜不光整，BCG與癌細(xì)胞作用24小時(shí)，細(xì)胞表面微絨毛減少，有的腫脹，長(zhǎng)突起大部分消失，小球狀結(jié)構(gòu)增多。與PPS聯(lián)合組細(xì)胞表面出現(xiàn)較多粗的突起物。BCG被吞入胞漿或胞核，線粒體腫脹，胞漿胞核物質(zhì)丟失，細(xì)胞呈溶解趨勢(shì)。 綜上所述：1．PPS體內(nèi)單獨(dú)刺激不

10、能促進(jìn)TLR分子的表達(dá)，聯(lián)合BCG可產(chǎn)生協(xié)同作用并促進(jìn)TLR分子和CD14的表達(dá)。2．PPS協(xié)同BCG可以促進(jìn)黏附分子CD11b分子的表達(dá)。3．PPS協(xié)同BCG作用24h促使NF-кBp65向核內(nèi)轉(zhuǎn)移。4．PPS、BCG作用初期(24h)尚不能顯著誘導(dǎo)炎癥因子的釋放。5．BCG對(duì)膀胱癌細(xì)胞有直接損傷作用，PPS有協(xié)同作用。 結(jié)論：豬苓多糖協(xié)同卡介苗作用初期能促進(jìn)巨噬細(xì)胞表面CD14、TLR2和TLR4分子，及黏附分子CD11b表