第一部分 尼克酰胺轉(zhuǎn)甲基酶（NNMT）在人腎癌組織中表達(dá)情況的研究;第二部分 針對PLK1的SiRNA對結(jié)腸癌細(xì)胞SW480作用的研究.pdf

1、本文研究工作分為兩部分：　　第一部分：尼克酰胺轉(zhuǎn)甲基酶(NNMT)在人腎癌組織中表達(dá)情況的研究。 本課題針對NNMTmRNA的結(jié)構(gòu)和表達(dá)量作了研究，設(shè)計(jì)了可以擴(kuò)增NNMTcDNA全長的引物，構(gòu)建了含NNMTcDNA全長片段的T-A克隆，證明了腎癌組織中存在著完整的NNMT1mRNA表達(dá)，并利用westernblot和免疫組化進(jìn)一步分析了NNMT蛋白在腎癌組織中的表達(dá)情況。 研究方法與結(jié)果： 采用RT-PCR和T

2、A克隆方法檢測了NNMT基因在腎臟組織中的表達(dá)。為了避免DNA污染對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，用于PCR擴(kuò)增的NNMT的上下游引物分別設(shè)計(jì)在第一和第三個(gè)外顯子上，之間相隔兩個(gè)內(nèi)含子序列。結(jié)果顯示腎臟組織中有NNMT基因的完整mRNA的表達(dá)，其核苷酸序列與肝組織NNMT(GenbankNM_006169)100％同源。 采用westernblot方法檢測人腎癌組織和癌旁組織中NNMT蛋白表達(dá)水平的差異。以actin作為內(nèi)參照，結(jié)果顯示腎癌組

3、織中NNMT蛋白含量高于癌旁組織。 采用常規(guī)的免疫組化方法對腎癌組織進(jìn)行染色。檢測人腎癌組織和癌旁組織中NNMT的蛋白表達(dá)情況，研究它在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)水平及亞細(xì)胞定位，并且比較其與正常細(xì)胞中的差異。因?yàn)橐苊饽I臟組織內(nèi)源性生物素較豐富引起的非特異性染色，二抗采用辣根過氧化物酶標(biāo)記。結(jié)果顯示NNMT蛋白在腎癌組織中有著極高的表達(dá)，它在細(xì)胞中的高表達(dá)分布呈彌漫性，在胞漿和胞核均有表達(dá)；在癌旁的對照腎組織中只有腎小管上皮細(xì)胞有較低水平

4、的表達(dá)，在腎小球沒有表達(dá)。 研究結(jié)論： 1、腎癌組織中存在NNMT基因的表達(dá)，即存在完整的NNMTmRNA分子。且RT-PCR半定量結(jié)果發(fā)現(xiàn)腫瘤組織NNMTmRNA表達(dá)水平高于癌旁組織。 2、腎癌組織中NNMT蛋白含量高于癌旁組織。 3、NNMT蛋白在腎癌組織中有著極高的表達(dá)，且胞漿和胞核均有陽性染色，在癌旁的對照腎組織中只有腎小管上皮細(xì)胞有較低水平的表達(dá)，在腎小球沒有表達(dá)。 第二部分 針對PLK

5、1的SiRNA對結(jié)腸癌細(xì)胞SW480作用的研究 PLK1(Polo-like kinase)是一種高度保守的絲氨酸/蘇氨酸激酶，對細(xì)胞周期的正常進(jìn)行、中心體成熟、胞質(zhì)分裂以及腫瘤的發(fā)生等方面均有重要影響，在大多數(shù)人類腫瘤中均表現(xiàn)為高表達(dá)。被認(rèn)為可以作為癌癥的血清標(biāo)志物。為了研究PLK1在腫瘤細(xì)胞生長和分裂中的作用，本文利用SiRNA技術(shù)在腫瘤細(xì)胞SW480中敲除了PLK1的mRNA表達(dá)并觀察了mRNA敲除后細(xì)胞生物學(xué)特征的改變