第一部分 人白介素12基因的克隆;第二部分 膽固醇對(duì)hVEC的損傷及單核細(xì)胞趨化蛋白-1表達(dá)的影響.pdf

1、第一部分,人白介素12基因的克隆.溶瘤病毒是一類在腫瘤細(xì)胞中特異性增殖的病毒.以溶瘤病毒為載體將外源抗癌基因?qū)肽[瘤細(xì)胞是劉新垣院士提出的一種治療腫瘤的新方法,稱為"溶瘤病毒的基因治療".該組采用了AD5型重組腺病毒系統(tǒng)來構(gòu)建這一類溶瘤病毒.這一系統(tǒng)由病毒基因組質(zhì)粒pBHG-E3和攜帶外源基因的穿梭質(zhì)粒重組而成.為構(gòu)建穿梭質(zhì)粒pCA13-hIL-12和pZD55-hIL-12,該實(shí)驗(yàn)先將PCR擴(kuò)增得到的人白介素12基因克隆到質(zhì)粒pCA1

2、3中,再將hIL-12基因連同pCA13中的表達(dá)框一起克隆到質(zhì)粒pZD55中.在質(zhì)粒構(gòu)建的過程中還在hIL-12基因中引入一個(gè)同義突變.經(jīng)過酶切及測(cè)序鑒定,實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了質(zhì)粒pCA13-hIL-12△和pZD55-hIL-12△,hIL-12基因的序列除一處點(diǎn)突變外其余完全正確.點(diǎn)突變處的Bgl Ⅱ核酸內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)失活,hIL-1 2氨基酸序列沒有改變.兩個(gè)穿梭質(zhì)粒用于構(gòu)建無增殖功能的腺病毒AD-CA13-hIL-12和具有腫瘤特異增

3、殖功能的腺病毒AD-ZD55-hIL-12.第二部分,膽固醇對(duì)hVEC的損傷及單核細(xì)胞趨化蛋白-1表達(dá)的影響.血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷是動(dòng)脈粥樣硬化(AS)發(fā)病的起始環(huán)節(jié),該工作研究了動(dòng)脈壁大量沉積的膽固醇對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷作用及其對(duì)單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)表達(dá)的影響.實(shí)驗(yàn)采用人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株ECV304為效應(yīng)細(xì)胞,分別以濃度為6.25mg/L,12.5mg/L,25.0mg/L,50.0mg/L的膽固醇作用于ECV304,用L

4、DH檢測(cè)試劑盒檢測(cè)培養(yǎng)液中LDH活性,細(xì)胞LDH滲出率,用高效液相色譜法檢測(cè)了基因組DNA甲基化水平,同時(shí)用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)了ECV304的MCP-1表達(dá)以及用比色法檢測(cè)了培養(yǎng)液中一氧化氮的生成量和一氧化氮合酶活性.結(jié)果與無膽固醇的對(duì)照組比較,膽固醇濃度為50.0mg/L時(shí)培養(yǎng)液中LDH活性顯著增加,25.0mg/L,50.0mg/L濃度組的細(xì)胞LDH滲出率有顯著增加,膽固醇濃度為50.0mg/L時(shí)DNA甲基化水平有顯著下降.6.25