γδT細(xì)胞在細(xì)粒棘球蚴感染中作用的初步研究.pdf

1、目的:通過研究包蟲病患者以及小鼠感染模型中γδT淋巴細(xì)胞免疫反應(yīng)，探討γδT淋巴細(xì)胞在包蟲感染免疫作用機制，為進一步探討抗包蟲病的免疫機制和包蟲病的防治提供新的實驗證據(jù)。
　　方法:（一）檢測包蟲病患者中γδT細(xì)胞的變化:流式細(xì)胞術(shù)檢測包蟲病患者和正常人γδT細(xì)胞數(shù)目和比例；流式分選γδT細(xì)胞并用anti-TCRγδ+IL-2刺激后觀察γδT細(xì)胞體外擴增培養(yǎng)；純化得到的rEg14-3-3進行SDS-PAGE電泳；對純化獲得的rEg

2、14-3-3進行western blot鑒定；MTT法和流式檢測不同抗原（囊液，囊壁，原頭蚴，rEg14-3-3）刺激γδT細(xì)胞增殖能力；ELISA檢測不同抗原（囊液，囊壁，原頭蚴，rEg14-3-3）刺激慢性包蟲病患者和正常人γδT細(xì)胞后IFN-γ，TNF-α，IL17A，TGF-β和IL-4細(xì)胞因子的表達；qRT-PCR檢測IFN-γ，Perforin，Granzyme A and B,和FasL mRNA的表達。
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3、檢測小鼠繼發(fā)感染模型中γδT細(xì)胞的變化：從包蟲病手術(shù)患者包囊中分離原頭蚴，經(jīng)腹腔注射感染BALB/c小鼠；建立細(xì)粒棘球蚴繼發(fā)感染動物模型；感染模型小鼠中小腸組織IEL淋巴細(xì)胞的分離，流式細(xì)胞術(shù)檢測IEL+γδT細(xì)胞數(shù)量及表型。
　　結(jié)果:細(xì)粒棘球蚴感染人后??T細(xì)胞檢測結(jié)果:從健康人與病人外周血中分離PBMCs，通過流式檢測發(fā)現(xiàn)，病人外周血中??T細(xì)胞無論從絕對數(shù)量還是從比例以及V?2亞型都明顯下降（有統(tǒng)計學(xué)意義）經(jīng)流分選出??T

4、細(xì)胞后，加入anti-TCRγδ+IL-2可促進其體外擴增；對體外擴增的??T細(xì)胞實驗研究發(fā)現(xiàn)，??T細(xì)胞對原頭蚴粗抗原刺激能夠產(chǎn)生明顯的增殖活化，而對囊液、囊壁以及重組抗原14-3-3無應(yīng)答（P<0.01）；對于經(jīng)不同成分刺激后，檢測發(fā)現(xiàn)對于原頭蚴刺激??T細(xì)胞細(xì)胞因子IFN-?與TNF-α顯著的升高（P<0.01）；T細(xì)胞在原頭蚴抗原刺激后，細(xì)胞毒作用分子（穿孔素，顆粒酶A和B，IFN-γ和FasL）的mRNA表達水平明顯上調(diào)，有統(tǒng)

5、計學(xué)意義（P<0.01）。
　　小鼠繼發(fā)感染細(xì)粒棘球蚴模型中??T細(xì)胞檢測結(jié)果:原頭蚴腹腔感染的模型小鼠建立成功；IEL細(xì)胞數(shù)量明顯減少（P<0.05）；小腸IEL+γδT細(xì)胞也明顯減少（P<0.05）。
　　結(jié)論:體外實驗證實，在細(xì)粒棘球蚴患者中，原頭蚴粗抗原可有效誘導(dǎo)外周血單個核細(xì)胞（PBMC）中γδT細(xì)胞擴增，其主要效應(yīng)分子IFN-γ的mRNA表達及分泌明顯增高，另外原頭蚴粗抗原可刺激穿孔素，顆粒酶A和B，F(xiàn)asL的m