納秒脈沖消融細(xì)粒棘球蚴感染的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)治療學(xué)評(píng)價(jià).pdf

1、目的：通過納秒脈沖電場(chǎng)（nanosecond pulsed electric filed, nsPEF）消融細(xì)粒棘球蚴（echinococcus granulosus, E.g）的體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，開展新型非致熱微創(chuàng)消融技術(shù)-納秒脈沖針對(duì)E.g的治療學(xué)評(píng)價(jià)。篩選納秒脈沖消融技術(shù)有效治療參數(shù)，評(píng)估其應(yīng)用于肝囊型包蟲?。╟ystic echinococcosis, CE）臨床治療的安全性和有效性。通過門靜脈注射E.g原頭蚴，模擬自然感染途徑，

2、建成小鼠肝E.g模型，經(jīng)調(diào)控門靜脈注射原頭蚴數(shù)量，優(yōu)化模擬臨床CE致病模型，重現(xiàn)小鼠門靜脈到肝臟的感染路徑和病程特征。采用納秒脈沖消融儀對(duì)該模型病灶進(jìn)行治療與評(píng)價(jià)，在體外實(shí)驗(yàn)中篩選在固定脈寬、頻率下，有效消融E.g的電場(chǎng)強(qiáng)度和脈沖個(gè)數(shù)，并在小鼠模型上驗(yàn)證其劑量效應(yīng)，獲得適宜治療E.g的電極布局。
　　方法：（1）采集臨床B超和CT診斷為單囊型肝囊型包蟲病CE,通過手術(shù)獲取CE患者的原頭蚴，經(jīng)過1％濃度胃蛋白酶消化后判斷原頭蚴活性，

3、配制濃度分別為2000個(gè)/100ul、200個(gè)/100ul、100個(gè)/100ul原頭蚴混懸液，經(jīng) C57BL/6小鼠門靜脈主干注射后觀察小鼠的死亡率，計(jì)算小鼠 E.g的成囊率和分布，B超隨訪觀察E.g囊腫的生長(zhǎng)速率；（2）B超篩查C57BL/6小鼠肝E.g囊腫，觀察固定脈寬350nm，頻率1Hz/s，50脈沖數(shù)下，不同場(chǎng)強(qiáng)（21、14、7、0kV/cm）作用后1周、4周、8周肝E.g囊腫的大小、形態(tài)改變、囊壁結(jié)構(gòu)改變判斷納秒脈沖對(duì)小鼠肝

4、 E.g囊腫的消融抑制效應(yīng)。（3）觀察固定脈寬350nm，頻率1Hz/s下，不同場(chǎng)強(qiáng)（29、21、14、7、0kV/cm）和脈沖數(shù)（50、100）作用后第1、3、7天原頭蚴的形態(tài)、活動(dòng)度、完整性，判斷納秒脈沖對(duì)其的殺傷效應(yīng)，HE染色觀察原頭蚴結(jié)構(gòu)的變化，掃描電鏡觀察原頭蚴超微結(jié)構(gòu)改變；采集臨床 B超和 CT診斷為多子囊型CE患者，選取直徑5-10mm、光亮透明，彈性好的CE囊腫，觀察固定脈寬350nm，頻率1Hz/s下，不同場(chǎng)強(qiáng)（29、

5、21、14、0kV/cm）和不同脈沖數(shù)（50、100）作用后第1、3、7天 E.g囊腫內(nèi)層塌陷情況判斷納秒脈沖對(duì)其的殺傷效應(yīng)，HE染色觀察 E.g囊腫壁結(jié)構(gòu)的變化。
　　結(jié)果：（1）建立門靜脈接種原頭蚴的小鼠模型：2000個(gè)/100ul、200個(gè)/100ul、100個(gè)/100ul原頭蚴混懸液經(jīng)門靜脈主干注射后小鼠感染率分別為90%（9/10）、100%（10/10）、63.6%（7/11），成囊率分別為0.7%～4.1%，0.6%

6、～1.9%，0.6%～3.9%。病理切片顯示注射后1周內(nèi)，大部分原頭蚴體積固縮，7天時(shí)原頭蚴周圍形成明顯的炎癥帶，21天時(shí)可見存活的原頭蚴發(fā)育出囊泡，42天時(shí)原頭蚴細(xì)胞團(tuán)消失，發(fā)育成一囊型病灶；（2）獲得納秒脈沖治療小鼠肝臟原位 E.g囊腫的有效劑量：小鼠 E.g囊腫在納秒脈沖治療儀脈沖后21kV/cm脈沖組小鼠 E.g直徑的增長(zhǎng)在脈沖后1、4、8周與對(duì)照組存在差異（P＜0.05），呈縮小趨勢(shì)，脈沖后1、4、8周的直徑分別縮小1.4mm

7、、1.2mm、1.7mm，肉眼觀E.g囊腫壁增厚，透明度消失，而對(duì)照組小鼠E.g囊腫光滑透明，壁較薄、彈性較好，腔內(nèi)囊液充盈清亮張力高，病理切片顯示脈沖后8周 E.g外纖維組織增厚，炎癥反應(yīng)帶增寬明顯；14kV/cm脈沖組小鼠E.g直徑的增長(zhǎng)在脈沖后8周與對(duì)照組存在差異（P＜0.05），呈縮小趨勢(shì)，脈沖后1、4、8周的直徑增長(zhǎng)分別為-0.4mm、0.4mm、-0.1mm；7kV/cm脈沖組小鼠E.g直徑的增長(zhǎng)與對(duì)照組無差異（P＞0.05

8、）；對(duì)照組在脈沖后1、4、8周的直徑增長(zhǎng)分別為0.2mm、1.3mm、4.3mm。（3）納秒脈沖對(duì)體外培養(yǎng)的原頭蚴和E.g囊腫的的殺滅存在劑量效應(yīng)：脈沖后第1、3天，29、21kV/cm脈沖組的原頭蚴的殺傷率與對(duì)照組存在差別（P＜0.05），50脈沖數(shù)下29、21kV/cm脈沖組第1天殺傷率分別為16.5%、12.9%，第3天的殺傷率分別為19%、12.6%；脈沖后第7天，29、21、14kV/cm脈沖組的原頭蚴的殺傷率與對(duì)照組存在差別

9、（P＜0.05），50脈沖數(shù)下29、21、14kV/cm脈沖組第7天殺傷率分別為71.7%、64.3%、48.3%。100脈沖數(shù)下29、21kV/cm脈沖組第1天殺傷率分別為32.3%、15.6%，第3天的殺傷率分別為32.3%、16.7%，100脈沖數(shù)下29、21、14kV/cm脈沖組第7天殺傷率分別為79.2%、68.7%、49.2%，透射電鏡見脈沖后原頭蚴體表完整性被破壞；脈沖處理后E.g囊腫第1天發(fā)生明顯的內(nèi)層塌陷，與對(duì)照組相比

10、存在差異（P＜0.05），脈沖場(chǎng)強(qiáng)越大，塌陷率越高，50脈沖數(shù)、29kV/cm場(chǎng)強(qiáng)下，1、3天的塌陷率分別為75%、100%，21kV/cm場(chǎng)強(qiáng)下，1、3、5天的塌陷率分別為50%、75%、100%，14kV/cm場(chǎng)強(qiáng)下，1、3、5、7天的塌陷率分別為25%、62.5%、75%、75%，100脈沖數(shù)、29kV/cm場(chǎng)強(qiáng)下，1、3、5、7天的塌陷率分別為62.5%、87.5%、87.5%、100%，21kV/cm場(chǎng)強(qiáng)下，1、3、5、7天的

11、塌陷率分別為50%、75%、75%、100%，14kV/cm場(chǎng)強(qiáng)下，1、3、5、7天的塌陷率分別為75%、87.5%、87.5%、100%。
　　結(jié)論：（1）經(jīng)小鼠門靜脈注射E.g原頭蚴可以成功建立小鼠E.g感染模型，注射200個(gè)原頭蚴可以得到較高的感染率和較合適的囊泡個(gè)數(shù)，囊泡生長(zhǎng)個(gè)數(shù)約1-4個(gè)，可以較好的模擬臨床CE；（2）21kV/cm場(chǎng)強(qiáng)可以明顯消融小鼠E.g，棘球蚴囊腫壁增厚，透明度消失，14kV/cm場(chǎng)強(qiáng)可以明顯抑制小

12、鼠E.g的生長(zhǎng)；7kV/cm場(chǎng)強(qiáng)對(duì)小鼠E.g的生長(zhǎng)無抑制作用。納秒脈沖對(duì)小鼠E.g囊腫具有劑量效應(yīng)，需要優(yōu)化治療參數(shù)，只有在足夠高的電場(chǎng)強(qiáng)度下才能獲得消融及抑制生長(zhǎng)作用。（3）固定脈寬350nm，頻率1Hz/s下，29、21kV/cm電場(chǎng)強(qiáng)度下對(duì)原頭蚴的殺傷效應(yīng)較明顯； E.g單囊腫對(duì)納秒脈沖的消融效應(yīng)較敏感，固定脈寬350nm，頻率1Hz/s下，29、21、14kV/cm電場(chǎng)強(qiáng)度下脈沖后第1天內(nèi)層塌陷明顯，場(chǎng)強(qiáng)越高、脈沖越數(shù)則E.g囊