放射治療棘球蚴病的體內(nèi)外實驗研究.pdf

1、研究目的：棘球蚴病俗稱包蟲病，流調(diào)表明我國有38萬包蟲病患者，現(xiàn)有手術(shù)資源很難完成所有治療，30余年的藥物治療效果亦不盡人意，需另辟治療途徑。本研究旨在探明X線殺傷包蟲的有效性和安全性，做為新技術(shù)的開發(fā)為臨床應(yīng)用提供證據(jù)。1）建立E.g體外成囊培養(yǎng)系統(tǒng)，為放射治療棘球蚴的體外實驗研究提供實驗材料。2）明確X線照射體外培養(yǎng)的原頭節(jié)和包囊的殺傷作用。3）探討放射治療對大鼠繼發(fā)泡球蚴（E.m）的療效和安全性。4）探討放射治療對自然感染羊細(xì)粒棘

2、球蚴（E.g）的療效和安全性。
　　研究方法：1）從屠宰場自然感染E.g的綿羊肝臟采集新鮮原頭蚴（PSC），經(jīng)1％的胃蛋白酶消化后檢測蟲體活性并計數(shù)，于37℃、5%C02條件下進(jìn)行體外培養(yǎng)，不同時間點（第1天、第7天、第15天、第60天）進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，超微結(jié)構(gòu)觀察，計算包囊的成囊率。2）將原頭蚴分裝于7組（每組3瓶），每瓶約2000個原頭蚴，對7組原頭蚴分別進(jìn)行0Gy、20Gy、40Gy、60Gy、80Gy、100Gy、120G

3、y劑量照射，機架角180度，射野大小10×10cm，SSD=100cm，劑量率300cGy/min，將包囊分裝于4組（每組3瓶），每瓶約200個包囊，1組為對照組，對其他3組包囊分別進(jìn)行30Gy/3f、45Gy/3f、60Gy/3f劑量照射，照射后電鏡及光鏡下觀察包囊的病理變化判斷療效，觀察半數(shù)致死量和時間，qRT-PCR檢測受X線照射前后關(guān)鍵基因表達(dá)的差異。3）建立雌性S-D大鼠繼發(fā)性泡球蚴病動物模型，隨機分為4組，每組15只，分別為

4、低、中、高劑量放射治療組和對照組，對照組不予任何處理，治療組給予6-MeV線照射，總劑量分別為30Gy、45Gy和60Gy，照射3次，每次間隔2天，放療結(jié)束1個月后檢測各組大鼠泡球蚴囊濕重、抑囊率，并對泡球蚴組織進(jìn)行病理組織學(xué)和超微結(jié)構(gòu)觀察。4）從新疆牧區(qū)用B超篩選53只自然感染肝細(xì)粒棘球蚴病的羊，經(jīng)CT驗證后將感染羊隨機抽取20只分配到四個實驗組中，高劑量組（60Gy）5只、中劑量組（45Gy）5只、低劑量組（30Gy）5只、對照組（

5、0Gy）5只。每只羊麻醉好后采用高分子低溫水解塑料熱壓成型體位固定技術(shù)固定，GE大孔徑螺旋CT掃描，放療醫(yī)師勾畫預(yù)照射包囊部位的靶區(qū)，物理師做照射計劃，核準(zhǔn)位置后實施圖像引導(dǎo)下的精確放療。照射組共照射3次，隔兩日一次，一周內(nèi)完成照射，達(dá)到預(yù)照射總量。放療后三月復(fù)查CT，對比放療前后目標(biāo)病灶的變化。處死各組綿羊，取出放療區(qū)肝內(nèi)細(xì)粒棘球蚴囊，用于光鏡和電鏡下觀察，qRT-PCR檢測受X線照射前后關(guān)鍵基因表達(dá)的差異，比較宿主和包囊的免疫反應(yīng)。

6、
　　結(jié)果：1）E.g原頭蚴在體外培養(yǎng)15d時微囊逐漸形成，60d時包囊外圍形成透明角質(zhì)層結(jié)構(gòu)，超微結(jié)構(gòu)顯示E.g囊泡外部有較厚的無細(xì)胞薄片層，并可見生發(fā)囊及囊內(nèi)PSC產(chǎn)生。2）不同劑量X線照射后14天后原頭節(jié)的成囊率P＜0.05，比較有統(tǒng)計學(xué)意義。6MV-X線照射原頭蚴后14天后，對照組成囊發(fā)育中，照射組發(fā)生了鉤突崩解，正常結(jié)構(gòu)消失。6MV-X線照射已成囊的包囊7天后，對照組包囊囊壁結(jié)構(gòu)完整，致密，照射組囊壁萎縮塌陷，正常結(jié)構(gòu)紊

7、亂消失，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張，部分為異常濃縮的染色團(tuán)塊。照射后7天，EgTPX、EgHSP70、EgEPC1、Csapase-3、Gadd45的隨著照射劑量的升高表達(dá)增強。3）低、中、高劑量放射治療組泡球蚴囊濕重分別為（1.82±0.74）g、（1.04±0.38）g和（0.76±0.33）g，抑囊率分別為50%、72%和82%，對照組泡球蚴囊濕重為（3.65±0.79）g，4組大鼠泡球蚴的平均濕重有顯著性差異（P＜0.05），光鏡結(jié)果顯示對照組

8、泡球蚴結(jié)構(gòu)基本正常，角質(zhì)層、生發(fā)層清晰，育囊內(nèi)有多少不等的原頭節(jié)，治療組泡球蚴呈不同程度的改變和破壞，結(jié)構(gòu)失常，角質(zhì)層、生發(fā)層普遍變性腫脹或分離脫落，原頭節(jié)少見，囊壁病理改變程度與對照組比較差異均有顯著性（P＜0.05），電鏡結(jié)果顯示治療組泡球蚴囊壁角質(zhì)層和生發(fā)層均有不同程度的損傷，其中60Gy放射治療組損害最重。4）CT結(jié)果顯示高劑量組中有4只羊的受照射包囊囊壁鈣化，HE染色結(jié)果顯示受照射包囊的角質(zhì)層及生發(fā)層結(jié)構(gòu)遭到不同程度破壞，普遍

9、變性腫脹或變薄，部分分離、斷裂、脫落，生發(fā)層細(xì)胞核溶解或消失，很少見育囊及原頭蚴。提取受照射包囊的RNA行熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示：EgTPX表達(dá)隨著劑量的升高表達(dá)降低，P＜0.05（P=0.04）；EgEPC1表達(dá)低劑量組明顯高于中高劑量組，P＜0.05（P=0.03）；EgHSP70表達(dá)隨著劑量的升高表達(dá)有降低的趨勢，但無統(tǒng)計學(xué)意義，P＞0.05（P=0.22）；說明隨著放療照射劑量的增加，包囊的活性被抑制。輻射相關(guān)的凋亡基因ca

10、spase-3和Gadd45基因的表達(dá)隨著劑量的升高表達(dá)降低。放療前后感染羊的一般生活狀況、體重、血常規(guī)、肝功、電解質(zhì)無明顯變化（P＞0.05）。
　　結(jié)論：1）建立了穩(wěn)定的E.g體外成囊培養(yǎng)平臺，為后續(xù)放射線抗棘球蚴的體外實驗研究提供了充足的實驗材料。2）X線對體外培養(yǎng)的原頭節(jié)和包囊確有殺傷作用，3）放射線有破壞大鼠泡球蚴囊壁結(jié)構(gòu)和抑制原頭節(jié)增殖的作用，且作用強度與劑量有關(guān)。4）放射治療后患羊的一般生活狀況、血常規(guī)和肝功未受到影