DHA抑制2型糖尿病大鼠肝臟炎癥改善胰島素抵抗的機制研究.pdf

1、目的:DHA(docosahexaenoicacid，C22:6n-3)是體內(nèi)重要的n-3系多不飽和脂肪酸。近些年研究發(fā)現(xiàn)DHA具有改善胰島素抵抗(insulinresistance，IR)以及抑制炎癥等作用，因此被用于預(yù)防及改善2型糖尿病(type2diabetes，T2D)，但其作用機制尚不完全清楚。
　　 肥胖誘導(dǎo)的慢性低度炎癥與胰島素抵抗之間的關(guān)系非常密切。許多研究證實，在細胞內(nèi)TNFα、IL-1β、IL-6等促炎因子信

2、號傳導(dǎo)途徑與胰島素信號通路之間存在交叉，可以抑制胰島素信號途徑，導(dǎo)致胰島素抵抗的發(fā)生。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，DHA具有很強的抗炎能力，有研究結(jié)果顯示，DHA通過抑制炎癥反應(yīng)而增加高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠脂肪組織的胰島素的敏感性。
　　 肝臟是參與體內(nèi)糖脂代謝的重要器官，同時也是胰島素抵抗發(fā)生的重要靶器官。與脂肪組織相比，在炎癥發(fā)生時，肝臟除了炎癥細胞侵潤以外，其本身固有的巨噬細胞(Kupffercells)會被激活，從而加劇炎癥反應(yīng)。

3、那么，DHA通過抑制炎癥而改善2型糖尿病肝臟胰島素抵抗的機制如何？
　　 因此，本課題用高脂飲食結(jié)合注射小劑量STZ的方法誘導(dǎo)肥胖2型糖尿病大鼠模型，通過飲食補充DHA，觀察2型糖尿病大鼠肝臟胰島素抵抗及炎癥反應(yīng)的改善情況，探討DHA通過抗炎改善肝臟胰島素抵抗的機制，為預(yù)防及治療2型糖尿病及其并發(fā)癥提供新的實驗依據(jù)。
　　 方法:
　　 1.實驗動物分組
　　 以本實驗室侯連國等人制備的2型糖尿病大鼠以及

4、飼喂DHA的2型糖尿病大鼠的肝臟為實驗材料。實驗動物分為對照(Con)組、2型糖尿病(T2D)組、T2D+DHA組。
　　 2.血清生化指標測定
　　 采用電子感應(yīng)法，用雅培安妥超越血糖儀測定空腹血糖。采用放射免疫法測定空腹血清胰島素。再通過計算胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)和胰島素敏感指數(shù)(HOMA-ISI)對大鼠整體胰島素抵抗水平進行評估。
　　 3.肝組織糖原含量測定
　　 用南京建成肝組織糖原含

5、量測定試劑盒，采用蒽酮法對肝組織中的糖原含量進行檢測。
　　 4.QuantitativeRT-PCR檢測目的基因mRNA表達水平
　　 用Promega公司總RNA提取試劑盒提取大鼠肝組織總RNA。以18SrRNA做內(nèi)參，QuantitativeRT-PCR測定G6Pase、PEPCK、TNFa、IL-1β、IL-6、IL-10、Arg-1mRNA的相對表達量。
　　 5.Westernblot檢測目的基因蛋白

6、表達水平
　　 提取大鼠肝組織總蛋白，Westernblot測定TAK1、P-TAK1、JNK、P-JNK、AKT、P-AKT、GSK3β、P-GSK3β和PEPCK蛋白的相對表達量。
　　 6.肝組織HE染色
　　 對大鼠肝組織石蠟切片進行HE染色，觀察肝組織的病理改變。
　　 7.數(shù)據(jù)處理
　　 實驗數(shù)據(jù)采用SPSS16.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，對測定結(jié)果進行正態(tài)性與方差齊性檢驗，數(shù)據(jù)用(x)±

7、s表示，三組之間兩兩比較使用多個均數(shù)比較的方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 1.DHA改善了2型糖尿病大鼠全身的胰島素抵抗
　　 結(jié)果表明，2型糖尿病大鼠具有明顯的胰島素抵抗特征，飲食補充DHA雖然不能降低2型糖尿病大鼠的血糖及血清胰島素水平，但可使2型糖尿病大鼠胰島素抵抗水平下降，胰島素敏感性增加。
　　 2.DHA改善了2型糖尿病大鼠肝臟的炎癥反應(yīng)
　　 2.1.

8、DHA對2型糖尿病大鼠肝臟炎癥細胞浸潤的影響
　　 對大鼠肝組織進行HE染色，觀察肝組織的病理改變，結(jié)果表明，飲食補充DHA能使2型糖尿病大鼠肝組織中炎細胞浸潤明顯減少。
　　 2.2.DHA對2型糖尿病大鼠肝臟促炎因子TNFα、IL-1β、IL-6mRNA表達的影響
　　 結(jié)果表明，2型糖尿病大鼠肝組織中促炎因子TNFα、IL-1β、IL-6的mRNA表達顯著增加，飲食補充DHA可使2型糖尿病大鼠肝組織促炎因子

9、的表達顯著減少。
　　 2.3.DHA對炎癥信號通路中TAK1、JNK活性形式的影響
　　 結(jié)果表明，2型糖尿病大鼠肝組織中TAK1和JNK被激活，飲食補充DHA能抑制2型糖尿病大鼠肝組織中TAK1和JNK的活化。說明DHA對TNFα介導(dǎo)的“TNFα-TAK1-JNK”炎癥信號通路有抑制作用。
　　 2.4.DHA對2型糖尿病大鼠肝臟抗炎因子IL-10、Arg-1mRNA表達的影響結(jié)果表明，2型糖尿病大鼠肝組織中

10、抗炎因子IL-10、Arg-1的mRNA表達顯著減少，飲食補充DHA可使2型糖尿病大鼠肝組織抗炎因子的表達增加。
　　 3.DHA改善了2型糖尿病大鼠肝臟的胰島素抵抗
　　 3.1.DHA對肝糖原代謝的影響
　　 結(jié)果表明，2型糖尿病大鼠肝組織中GSK3β被激活，使糖原合酶磷酸化失活，使肝組織不能正常合成糖原，表現(xiàn)為糖原含量下降，而飲食補充DHA能抑制GSK3β的活化，使糖原合成增加。
　　 3.2.DH

11、A對糖異生相關(guān)基因表達的影響
　　 結(jié)果表明，2型糖尿病大鼠肝組織糖異生的關(guān)鍵酶PEPCK和G6Pase的mRNA表達顯著增強，使肝臟糖異生作用增強，而飲食補充DHA只能使2型糖尿病大鼠肝組織中PEPCK的mRNA及蛋白表達降低。
　　 3.3.DHA對胰島素信號通路中AKT活性形式的影響
　　 結(jié)果表明，2型糖尿病大鼠肝組織中AKT活化被抑制，飲食補充DHA能使2型糖尿病大鼠肝組織中AKT活化。說明DHA可以通

12、過減少TNFα的表達，抑制“TNFα-TAK1-JNK”信號通路，從而改善2型糖尿病大鼠肝臟的胰島素抵抗。
　　 結(jié)論:
　　 1.DHA改善了2型糖尿病大鼠全身的胰島素抵抗。
　　 2.DHA改善了2型糖尿病大鼠肝臟的胰島素抵抗和炎癥反應(yīng)。
　　 3.DHA通過下調(diào)TNFα介導(dǎo)的“TNFα-TAK1-JNK”炎癥信號通路，解除了對胰島素“Ins/IRS-PI3K-AKT”信號的抑制，改善肥胖2型糖尿病肝