球孢白僵菌營養(yǎng)親和型的研究.pdf

1、將一株林間釋放菌株Bb13以及111株從皖南宣城球孢白僵菌放菌區(qū)僵蟲、空氣和土壤中分離獲的球孢白僵菌土著菌株在SDAY上進(jìn)行配對培養(yǎng)，了解彼此間的營養(yǎng)親和性。結(jié)果表明，112個(gè)菌株分屬于9個(gè)營養(yǎng)親和群(VCG)，VCG01由36個(gè)菌株組成，VCG02由23個(gè)菌株組成，VCG03含25個(gè)菌株，VCG05含16個(gè)菌株，VCG13含8個(gè)菌株，VCG26、VCG27、VCG28和VCG29均只包含一個(gè)菌株。其中111株土著菌株中有35株與Bb1

2、3是親和的，親和比例為31.53％；有76株與Bb13不親和，不親和比例為68.47％。這些結(jié)果揭示了馬尾松林生態(tài)系中球孢白僵菌具高度的種群異質(zhì)性和豐富的遺傳多樣性。釋放菌株Bb13的13個(gè)單孢子株在第一代均是親和的，繼代10代后，有7個(gè)子株的營養(yǎng)體親和性沒發(fā)生改變，6個(gè)菌株發(fā)生了改變。由此可見，繼代培養(yǎng)會使單孢株的營養(yǎng)親和發(fā)生改變。 對包括上述112個(gè)菌株的地理來源不同的245株球孢白僵菌在SDAY培養(yǎng)基上直接配對培養(yǎng)，進(jìn)行營

3、養(yǎng)親和分析，結(jié)果表明，它們可劃分為29個(gè)VCG，VCG01由62個(gè)菌株組成，VCG02含25個(gè)菌株構(gòu)成，VCG03含23個(gè)菌株，VCG04含20個(gè)菌株，VCG05所含的16個(gè)菌株均采自宣州，VCG06含9個(gè)菌株，VCG07、VCG11、VCG12和VCG14都由6個(gè)菌株組成，VCG08含9個(gè)菌株，VCG09和VCG10都含有7個(gè)菌株，VCG13含8個(gè)菌株，VCG15、VCG18和VCG19均包含5個(gè)菌株，VCG16、VCG17均含4個(gè)菌

4、株，VCG20含3個(gè)菌株，VCG21由采自岳西的2個(gè)菌株組成；VCG22、VCG23、VCG24、VCG25、VCG26、VCG27、VCG28以及VCG29都只由一個(gè)菌株構(gòu)成。各地區(qū)都有一個(gè)較大的優(yōu)勢VCG群體，占有本地區(qū)約三分之一的菌株數(shù)。各VCG的菌株按照各自的采集地、不同的分離寄主分別計(jì)算，不同的地理來源平均6.03個(gè)菌株組成1個(gè)VCG，其P及Shannon-Wiener多樣性指數(shù)分別為0.1659及0.7609；由不同目寄主上

5、分離的菌株平均2.63個(gè)菌株形成1個(gè)VCG，P及Shannon-Wiener多樣性指數(shù)分別為0.3800和1.1065。由此可見，相同地理來源的營養(yǎng)親和型多樣性要明顯小于相同分離寄主的菌株，來源于同一地區(qū)的菌株屬于同一VCG的概率要大于相同分離寄主的菌株。 包含地理來源不同的菌株，例如，本試驗(yàn)釋放的安徽霍邱Bb13與來自日本的Bb202屬于同一個(gè)VCG。地理來源相同的菌株分屬不同的親合群，可能與不同菌株?duì)I養(yǎng)親和這一遺傳特性的形成

6、受到小范圍生態(tài)位的微環(huán)境的影響有關(guān)。 對20個(gè)含菌株數(shù)較多的VCG進(jìn)行遺傳多樣性研究的結(jié)果表明，總體看來，各VCG菌株的28SrDNA域的Ⅰ型內(nèi)含子的單倍型種類多樣；另外，在同一VCG中，沒有占比例較大的單倍體類型。POPGENE分析結(jié)果表明：Nei's基因多樣性指數(shù)最大可達(dá)0.4589，最小為0.0326，但結(jié)合多態(tài)性信息量PIC分析，最大的多態(tài)信息量為0.9278，最小的為0.4978。以上結(jié)果表明，各VCG菌株的營養(yǎng)親和遺

7、傳型與Ⅰ型內(nèi)含子的類型沒有直接的相關(guān)性。 通過篩選硝酸鹽營養(yǎng)缺陷(Nit)突變體，利用營養(yǎng)體親和技術(shù)，對6個(gè)球孢白僵菌菌株的VCG進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示6個(gè)菌株分屬于2個(gè)VCG，其中一個(gè)VCG由5個(gè)菌株組成，另外一個(gè)VCG僅由1個(gè)菌株組成。通過E23/E24、I21/I22、I31/I32、I38/I29四對引物對6個(gè)出發(fā)菌株28SrDNAD8-D11域4種不同的內(nèi)含子的研究，僅篩選出一對引物(I21/I22)擴(kuò)增出菌株Bb13和

8、Bb192有不同的特征帶；在其它位點(diǎn)的內(nèi)含子均相同。另外，對8個(gè)ISSR引物進(jìn)行篩選，結(jié)果顯示，有3個(gè)引物在5個(gè)菌株中共擴(kuò)增出41條帶，其中11條為多態(tài)性條帶，多態(tài)性為26.83％，采用這3條引物擴(kuò)增結(jié)果可明顯看到Bb13與其它5個(gè)出發(fā)菌株間的差異條帶。 將采用的Nit技術(shù)確定的同一VCG的菌株成對配對接種在馬尾松毛蟲3齡幼蟲活體上3-12d后感染致死的僵蟲體表長出白色菌絲。用2對引物I21/I22和I31/I32，對12個(gè)分離

9、株的28SrDNAD8-D11域進(jìn)行擴(kuò)增，12株用從Bb13和Bb192配接致死的蟲尸上分離的分離株用引物I21/I22擴(kuò)增出的在第二個(gè)位點(diǎn)上同時(shí)具有Bb13和Bb192兩個(gè)菌株的特征條帶，表明基因重組率高達(dá)100％。將12株分離株在人工培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)所得的F1代子株采用相同條件的擴(kuò)增結(jié)果顯示，12個(gè)菌株中，只有4個(gè)菌株在第二個(gè)位點(diǎn)上保持了異核體；將此四個(gè)分離株在人工培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)所得的F2代子株繼續(xù)擴(kuò)增的結(jié)果顯示，只有1個(gè)菌株仍保