維生素A對體外培養(yǎng)人臍帶間充質干細胞生物學特性的影響.pdf

1、間充質干細胞屬于成體干細胞的一種，目前研究的間充質干細胞大多來源于人或動物的成體組織中。近幾年臍帶間充質干細胞以其豐富的來源、方便的取材、對供體無不良影響、無倫理限制等優(yōu)點逐漸成為了研究的熱點。此外，維生素A促進多種細胞體外增殖的作用已有報道。本試驗擬從人臍帶組織分離間充質干細胞，采用免疫組化及RT-PCR檢測其相關標志基因、細胞凋亡基因和部分細胞因子生成能力，分析維生素A對體外培養(yǎng)人臍帶間充質干細胞生物學特性的影響。試驗獲得如下結果:

2、
　　人臍帶來源間充質干細胞的分離培養(yǎng)及鑒定
　　通過酶消化法分離臍帶間充質干細胞，結果顯示:(1)0.1％Ⅳ型膠原酶、0.1％Dnase酶、0.1％透明質酸酶聯(lián)合4℃消化過夜后用0.25％胰蛋白酶-0.02％EDTA，37℃消化25min為獲得人臍帶源間充質干細胞的最適條件。(2)人臍帶組織經(jīng)組合酶消化后，呈圓形或橢圓形懸浮于培養(yǎng)液中，培養(yǎng)1-2天后細胞完全貼壁，成不規(guī)則的成纖維樣細胞生長。(3)人臍帶源間充質干細胞生長曲

3、線呈S型，2d后進入對數(shù)生長期，6d后開始進入平臺期。(4)凍存前細胞活率為90.23％，復蘇后的細胞活率為87.61％。(5)免疫組化結果顯示，細胞表達間充質干細胞標志基因CD29、CD44、CD105，干細胞標記基因Oct4、Nanog、Sox2，不表達上皮細胞標記基因CD31和造血干細胞標記基因CD34。
　　上述結果表明，試驗培養(yǎng)所得細胞可初步鑒定為人臍帶間充質干細胞，并且符合進一步試驗要求。
　　2、維生素A對人臍

4、帶間充質干細胞生長狀況的影響
　　分別在FBS+DMEM/F12和KSR+DMEM/F12的培養(yǎng)中添加濃度為1μmol/L維生素A，分析維生素A對臍帶間充質干細胞生長的影響。結果如下:(1) MTT檢測結果顯示，添加維生素A培養(yǎng)后，細胞增殖加快。(2) RT-PCR檢測結果顯示，在添加維生素A培養(yǎng)后，細胞中干細胞標記基因Nanog上調表達，細胞增殖基因PCNA、C-myc上調表達，細胞凋亡基因Bcl-x下調表達。(3)免疫組化及R

5、T-PCR檢測顯示，添加維生素A培養(yǎng)連續(xù)培養(yǎng)細胞20代后，細胞仍表達間充質干細胞標志基因CD29、CD44、CD105，干細胞標記基因Oct4、Nanog、Sox2，不表達上皮細胞標記基因CD31和造血干細胞標記基因CD34。
　　上述結果表明，濃度為1μmol/L的維生素A可能通過上調Nanog基因的上調表達激活細胞增殖通路，調節(jié)細胞增殖基因PCNA、C-myc和細胞凋亡基因Bcl-x的表達，進而促進人臍帶源間充質干細胞增殖。<

6、br>　　3、維生素A對人臍帶間充質干細胞分泌相關細胞因子的影響
　　分別在FBS+DMEM/F12和KSR+DMEM/F12的培養(yǎng)基中添加濃度為1μmol/L的維生素A，對4組細胞不同時間點時細胞增殖相關因子的表達量和蛋白的分泌量進行檢測。(1) RT-PCR檢測結果顯示人臍帶源間充質干細胞表達細胞因子基因LIF、SCF、CSF1、EGF和bFGF?；駿GF在KSR組中的表達量顯著高于FBS組，基因SCF在添加維生素A組的表達