生長(zhǎng)素受體SlTIR1-AFBs家族基因在番茄生長(zhǎng)與發(fā)育中的調(diào)控機(jī)制研究.pdf

1、生長(zhǎng)素作為一種重要的植物激素，參與植物生長(zhǎng)和發(fā)育諸多過(guò)程以及調(diào)控許多生理反應(yīng)。生長(zhǎng)素通過(guò)介導(dǎo)其受體 TIR1/AFB與轉(zhuǎn)錄抑制子 Aux/IAA蛋白直接相互作用，促使 Aux/IAA蛋白降解，將下游的轉(zhuǎn)錄因子 ARF去抑制化，從而激活生長(zhǎng)素信號(hào)通路，使得植物最終表現(xiàn)出生理反應(yīng)。植物對(duì)生長(zhǎng)素的響應(yīng)是一個(gè)極其復(fù)雜的過(guò)程，存在著嚴(yán)密的調(diào)控機(jī)制。因此，研究生長(zhǎng)素的作用機(jī)制對(duì)深入認(rèn)識(shí)植物生長(zhǎng)發(fā)育的生理過(guò)程有著重要的意義。
　　番茄是一種重要

2、經(jīng)濟(jì)作物，也是研究一些重要性狀，如：復(fù)葉、聚傘花序以及果實(shí)發(fā)育、成熟的模式植物。TIR1/AFB蛋白作為生長(zhǎng)素受體，處于生長(zhǎng)素信號(hào)通路中關(guān)鍵位置，研究生長(zhǎng)素受體基因功能至關(guān)重要。但是生長(zhǎng)素受體及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)對(duì)番茄復(fù)葉及花器官發(fā)育、果實(shí)形成的調(diào)控機(jī)制仍缺乏了解。
　　本論文以番茄為研究材料，通過(guò)生物信息學(xué)、遺傳轉(zhuǎn)化、組織切片法、生理生化、分子生物學(xué)等方法分析了 SlTIR1/AFBs基因家族成員的結(jié)構(gòu)、表達(dá)、蛋白互作特性及其功能，以期揭

3、示生長(zhǎng)素受體 SlTIR1/AFBs同源基因家族成員對(duì)番茄生長(zhǎng)、發(fā)育調(diào)控功能的差異性以及在生長(zhǎng)素信號(hào)中調(diào)控方式，同時(shí)闡明 SlmiR393在轉(zhuǎn)錄后介導(dǎo)生長(zhǎng)素受體基因調(diào)控影響番茄發(fā)育的作用機(jī)制。這些研究結(jié)果為深入闡明生長(zhǎng)素信號(hào)對(duì)番茄生長(zhǎng)與發(fā)育的分子調(diào)控機(jī)理具有重要意義，也為生產(chǎn)實(shí)踐提供理論依據(jù)。本文主要研究結(jié)果如下：
　?、偻ㄟ^(guò)同源序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，番茄基因組中含有4個(gè) SlTIR1/AFBs生長(zhǎng)素受體基因家族成員?；蚪M結(jié)構(gòu)分析發(fā)

4、現(xiàn)，SlTIR1/AFBs基因家族都由2個(gè)內(nèi)含子、2-4個(gè)外顯子、高度保守的 F-BOX結(jié)構(gòu)域和多個(gè)亮氨酸富集重復(fù)（LRR）結(jié)構(gòu)域組成。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)，番茄 SlTIR1/AFBs基因家族成員分別歸屬為 TIR1、AFB4及AFB6三個(gè)亞家族。
　?、谕ㄟ^(guò)定量PCR技術(shù)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)SlTIR1A、SlTIR1B、SlAFB4與SlAFB6基因在番茄生長(zhǎng)與發(fā)育階段中具有不同的表達(dá)模式。同時(shí)，proSlTIR1/AFBs-GUS融合

5、表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系的 GUS組織化學(xué)染色觀察發(fā)現(xiàn)，SlTIR1A主要在花器官中的萼片、花藥、子房以及早期果實(shí)中的胎座部位表達(dá)；SlTIR1B主要在葉柄、葉脈，子房中胚珠以及早期發(fā)育果實(shí)的胎座、果皮上表達(dá)；SlAFB4主要在側(cè)根、花器官中萼片、柱頭、果皮、果肉上表達(dá)；SlAFB6主要在葉柄、萼片、花藥、果皮部位表達(dá)。這說(shuō)明 SlTIR1/AFBs家族基因的表達(dá)模式既有組織特異性，也有相似性。此外，采用 qPCR定量技術(shù)和 proSlTIR1/

6、AFBs-GUS融合表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系 GUS組織化學(xué)染色分析發(fā)現(xiàn)，外源生長(zhǎng)素(IAA)明顯抑制 SlTIR1/AFBs基因表達(dá)，說(shuō)明SlTIR1/AFBs轉(zhuǎn)錄本受到外源生長(zhǎng)素負(fù)調(diào)控作用。
　?、蹃喖?xì)胞定位顯示 Sl-TIR1A、Sl-TIR1B、Sl-AFB4及 Sl-AFB6受體蛋白均位于細(xì)胞核中。通過(guò)酵母雙雜交法(Y2H)和雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)(BiFC)對(duì)番茄 Sl-TIR1/AFBs生長(zhǎng)素受體蛋白的功能進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明：Sl

7、-TIR1/AFBs與 ASK1蛋白進(jìn)行互作形成TIR1/AFB-ASK1蛋白復(fù)合體；Sl-TIR1/AFBs受體蛋白能與At-IAA7蛋白以依賴于生長(zhǎng)素的方式相互作用。同時(shí)，對(duì) Sl-TIR1/AFBs蛋白功能結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)-BOX結(jié)構(gòu)域是Sl-TIR1/AFBs-ASK1蛋白復(fù)合體形成必需的。F-BOX與多個(gè)亮氨酸富集重復(fù)(LRR)結(jié)構(gòu)域影響Sl-TIR1/AFBs與Aux/IAA蛋白結(jié)合的穩(wěn)定性。因此，推測(cè)番茄 SlTIR1/

8、AFBs生長(zhǎng)素受體同源基因表現(xiàn)出受體蛋白相似的功能與特征。
　?、芡ㄟ^(guò)超量表達(dá)或 RNAi抑制表達(dá)方式對(duì)番茄 SlTIR1/AFBs基因家族成員進(jìn)行調(diào)控表達(dá)。結(jié)果表明：在超量表達(dá)和RNAi抑制表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株中SlTIR1/AFBs基因的表達(dá)水平都有不同程度的上調(diào)或下調(diào)。對(duì)轉(zhuǎn)基因番茄幼苗進(jìn)行生長(zhǎng)素反應(yīng)分析發(fā)現(xiàn)，SlTIR1A/B比其他兩個(gè)家族成員 SlAFB4、SlAFB6更能影響番茄對(duì)生長(zhǎng)素敏感性。
　?、萃ㄟ^(guò)酵母雙雜交法(

9、Y2H)和雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)(BiFC)證實(shí)了番茄中 Sl-TIR1/AFBs與 Sl-Aux/IAAs蛋白互作是依賴于生長(zhǎng)素，明確了番茄不同 Sl-TIR1/AFBs生長(zhǎng)素受體對(duì) Aux/IAAs蛋白的特異性結(jié)合調(diào)控方式。通過(guò)定量 PCR技術(shù)檢測(cè)參與生長(zhǎng)素信號(hào)通路兩個(gè)重要家族基因 Aux/IAA與 ARF的轉(zhuǎn)錄水平在轉(zhuǎn)基因株系中變化情況，結(jié)果表明：SlTIR1A、SlTIR1B、SlAFB4與 SlAFB6在轉(zhuǎn)錄水平上不同程度對(duì)Aux

10、/IAA及ARF基因進(jìn)行特異地調(diào)控。
　?、迣?duì)轉(zhuǎn)基因株系的功能鑒定發(fā)現(xiàn)：超量表達(dá) SlTIR1A影響花器官的發(fā)育及導(dǎo)致番茄座果不依賴于授粉/授精作用。同時(shí)，從組織切片法、生理生化與分子生物學(xué)等方面分析，初步揭示了 SlTIR1A參與果實(shí)起始發(fā)育的作用機(jī)理；超量表達(dá)SlTIR1B的轉(zhuǎn)基因株系出現(xiàn)生長(zhǎng)素相關(guān)多效性的表型，如：頂端優(yōu)勢(shì)減弱、促進(jìn)腋芽發(fā)育、改變?nèi)~片形態(tài)、子房發(fā)育、果實(shí)形態(tài)等。這也表明 SlTIR1B作為生長(zhǎng)素信號(hào)正調(diào)控因子

11、，影響了番茄營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)與果實(shí)發(fā)育；下調(diào)表達(dá) SlAFB4影響番茄側(cè)根的形成。這體現(xiàn)了 SlTIR1/AFBs基因家族成員在番茄生長(zhǎng)、發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著不同的調(diào)控作用。
　?、叱勘磉_(dá)Sl-miR393導(dǎo)致SlTIR1A、SlTIR1B、SlAFB6 mRNA水平下調(diào)，且在不同組織中靶基因表達(dá)被下調(diào)程度不一致，說(shuō)明 SlmiR393在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控靶基因具有組織特異性。對(duì)SlAFB6基因與Sl-miR393特異結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變，構(gòu)建了不

12、受SlmiR393剪切的SlAFB6(mSlAFB6)且不改變蛋白序列，并對(duì)mSlAFB6進(jìn)行超量表達(dá)。通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)基因株系的功能鑒定發(fā)現(xiàn)：超量表達(dá)mSlAFB6對(duì)番茄復(fù)葉發(fā)育和萼片形態(tài)產(chǎn)生影響，如葉片融合、葉片細(xì)胞形態(tài)改變、葉脈結(jié)構(gòu)改變以及萼片融合。RNA-seq轉(zhuǎn)錄組分析表明：22個(gè) DEG與生長(zhǎng)素代謝、運(yùn)輸及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)，以及27個(gè) DEG參與調(diào)控側(cè)生器官發(fā)育的轉(zhuǎn)錄因子。這也說(shuō)明SlmiR393介導(dǎo) SlAFB6調(diào)控影響番茄側(cè)生器官邊