柔嫩艾美耳球蟲(chóng)絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶特性研究.pdf

1、雞球蟲(chóng)病是一種嚴(yán)重危害養(yǎng)禽業(yè)發(fā)展的全球性寄生蟲(chóng)病，其在集約化養(yǎng)殖場(chǎng)中的發(fā)病率高達(dá)50％-70%，死亡率為20%-30%，嚴(yán)重時(shí)甚至可達(dá)80%，每年給全球養(yǎng)禽業(yè)造成的直接經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)5億英鎊。在公認(rèn)的7種雞球蟲(chóng)中，柔嫩艾美耳球蟲(chóng)（Eimeria tenella）分布最廣，致病力最強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)室前期利用酵母雙雜交技術(shù)篩選了重要入侵相關(guān)分子——頂體膜抗原1（AMA1）的相互作用蛋白時(shí)，獲得了一些可能與其相互作用的蛋白的ESTs序列，本研究選取其

2、中編號(hào)為56-2的EST序列進(jìn)行克隆、表達(dá)和初步功能分析，驗(yàn)證了其與EtAMA1蛋白的相互作用關(guān)系，并對(duì)其作為新型核酸疫苗候選分子的潛力進(jìn)行了評(píng)估。
　　1.柔嫩艾美耳球蟲(chóng)EtSTK基因的克隆和生物信息學(xué)分析
　　根據(jù)所獲EST序列ORF設(shè)計(jì)引物，通過(guò)RACE獲得該基因的全長(zhǎng)cDNA序列，對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)其與本實(shí)驗(yàn)室前期發(fā)現(xiàn)的柔嫩艾美耳球蟲(chóng)子孢子與未孢子化卵囊的差異表達(dá)基因ZB1-A08序列100%同源，含有一個(gè)

3、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（STK）結(jié)構(gòu)域，遂將其命名為柔嫩艾美耳球蟲(chóng)絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（EtSTK）。該基因全長(zhǎng)1799 bp，ORF1524 bp，編碼507個(gè)氨基酸，理論分子量為54 kDa，預(yù)測(cè)等電點(diǎn)為8.36，無(wú)信號(hào)肽，可能含24個(gè)抗原位點(diǎn)。RT-PCR結(jié)果顯示該基因在蟲(chóng)體子孢子中的轉(zhuǎn)錄水平明顯高于未孢子化卵囊、孢子化卵囊和第二代裂殖子，表明其轉(zhuǎn)錄水平受蟲(chóng)體階段性調(diào)控。
　　2.柔嫩艾美耳球蟲(chóng)EtSTK蛋白的原核表達(dá)和功

4、能初步研究
　　本研究構(gòu)建了pCold I-EtSTK原核表達(dá)重組質(zhì)粒，并將其轉(zhuǎn)入BL21（DE3）大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞表達(dá)，成功獲得了可溶性重組蛋白。使用Ni柱親和層析純化重組蛋白后免疫新西蘭大白兔，成功得到EtSTK重組蛋白多抗血清，Western blot結(jié)果顯示該重組蛋白具有良好的免疫原性和反應(yīng)原性；IFA結(jié)果顯示EtSTK主要位于游離子孢子頂端的表面；而在入侵細(xì)胞后主要集中在子孢子的頂端；在隨后的發(fā)育中，蛋白主要分布在滋養(yǎng)

5、體和未成熟裂殖體的表面；當(dāng)蟲(chóng)體發(fā)育至成熟裂殖體時(shí)，蛋白主要分布在第一代裂殖子的兩端。體外抑制結(jié)果顯示，與正常兔IgG處理組相比，抗EtSTK多克隆抗體IgG處理組對(duì)子孢子入侵DF-1細(xì)胞的抑制率明顯上升，且抑制率與抗體濃度呈正相關(guān)，在抗體濃度為400μg/mL時(shí)，抑制率高達(dá)約70%，提示EtSTK蛋白在柔嫩艾美耳球蟲(chóng)子孢子入侵宿主細(xì)胞過(guò)程中發(fā)揮重要作用。
　　3. EtSTK蛋白與EtAMA1蛋白相互作用關(guān)系的驗(yàn)證
　　本研

6、究以柔嫩艾美耳球蟲(chóng)子孢子cDNA為模板，PCR擴(kuò)增EtSTK基因，將擴(kuò)增產(chǎn)物與真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-flag連接，構(gòu)建重組真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-flag-EtSTK，測(cè)序鑒定正確后，轉(zhuǎn)染DF-1細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)，利用Western blot和間接免疫熒光（IFA）對(duì)其表達(dá)情況進(jìn)行鑒定。結(jié)果成功地構(gòu)建了重組質(zhì)粒pcDNA3.1-flag-EtSTK；Western blot顯示在54 kDa處出現(xiàn)條帶；IFA檢測(cè)到特異性的綠色

7、熒光，表明構(gòu)建的重組質(zhì)粒pcDNA3.1-flag-EtSTK成功地在DF-1中實(shí)現(xiàn)了表達(dá)。遂以此為基礎(chǔ)，通過(guò)Co-IP和GST Pull-Down技術(shù)對(duì)EtSTK蛋白與EtAMA1蛋白相互作用關(guān)系進(jìn)行了驗(yàn)證。Co-IP結(jié)果顯示，抗EtSTK多克隆抗體可以沉淀EtSTK蛋白與EtAMA1蛋白形成的復(fù)合體；抗EtAMA1單克隆抗體亦能沉淀EtSTK蛋白與EtAMA1蛋白形成的復(fù)合體。GST Pull-Down結(jié)果顯示，以EtAMA1蛋白為

8、誘餌進(jìn)行GST Pull-Down實(shí)驗(yàn)可以成功捕捉到EtSTK蛋白。將子孢子置于DMEM培養(yǎng)基孵育2 h后，利用EtSTK兔源抗體和EtAMA1鼠源抗體對(duì)其進(jìn)行免疫熒光共定位，結(jié)果顯示，EtSTK蛋白和EtAMA1蛋白均定位于經(jīng)DMEM處理后子孢子的頂端，且兩者位置重合。免疫熒光共定位、Co-IP和GST Pull-Down結(jié)果均表明EtSTK蛋白可以與EtAMA1蛋白發(fā)生相互作用，驗(yàn)證了實(shí)驗(yàn)室前期酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)所獲的結(jié)果。
　　

9、4.重組真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-flag-EtSTK的免疫保護(hù)效能評(píng)價(jià)
　　將劑量為100μg/羽、200μg/羽的真核重組質(zhì)粒pcDNA3.1-flag-EtSTK和空質(zhì)粒pcDNA3.1-flag以肌肉注射的方式分別免疫7日齡雛雞，同時(shí)設(shè)置非免疫攻蟲(chóng)組和非免疫非攻蟲(chóng)組。7d后進(jìn)行二免，免疫劑量和免疫方式與一免相同。二免后第7d除了非免疫非攻蟲(chóng)組之外，其余各組用柔嫩艾美耳球蟲(chóng)上海株1.5×104個(gè)孢子化卵囊進(jìn)行攻蟲(chóng)，檢測(cè)雞

10、的增重、盲腸病變記分、卵囊產(chǎn)量等指標(biāo)。結(jié)果可知，各免疫組在免疫期間的增重與不免疫組的相當(dāng)，在攻蟲(chóng)期間的增重均稍高于健康組，但差異不顯著，不免疫攻蟲(chóng)組的增重稍低于健康組，但差異不顯著。真核重組質(zhì)粒組的卵囊產(chǎn)量明顯低于不免疫攻蟲(chóng)組，卵囊減少率在74.07%-78.13%；而空載體質(zhì)粒組的卵囊產(chǎn)量與不免疫攻蟲(chóng)組差異不顯著，卵囊減少率在40.39%-46.03%。真核質(zhì)粒免疫組和空載體免疫組僅出現(xiàn)輕微的病變，各組病變記分與健康組差異不顯著，均明

11、顯低于非免疫攻蟲(chóng)組。結(jié)果表明，真核重組質(zhì)粒pcDNA3.1-flag-EtSTK對(duì)感染柔嫩艾美耳球蟲(chóng)雞具有一定的保護(hù)效果。
　　5. EtSTK蛋白與宿主細(xì)胞作用蛋白的篩選
　　將重組真核表達(dá)質(zhì)粒 pcDNA3.1-flag-EtSTK轉(zhuǎn)染入 DF-1細(xì)胞，收集蛋白進(jìn)行 CoIP實(shí)驗(yàn)， SDS-PAGE結(jié)果顯示，EtSTK抗體處理與未處理的DF-1細(xì)胞蛋白之間的蛋白泳帶存在著明顯差異。經(jīng)shotgun質(zhì)譜分析，并對(duì)獲得的蛋白

12、質(zhì)肽段與Uniprot中雞（Gallus_gallus）蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)EtSTK抗體處理后DF-1細(xì)胞蛋白樣品含有28種蛋白，而未處理的DF-1細(xì)胞蛋白樣品含有345種蛋白，二者之間同時(shí)存在的蛋白有12種，其中獲得肽段數(shù)量最多的為雞肌凝蛋白（Myosin-9）、波形蛋白（Vimenti）、應(yīng)激蛋白70（Stress-70 protein）、葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白（glucose-regulated protein）等。本試驗(yàn)篩選獲得