桔小實蠅胰島素信號通路基因表達特性及功能研究.pdf

1、桔小實蠅Bactrocera dorsalis(Hendel)隸屬雙翅目Diptera、實蠅科Tephritidae，是一種廣泛分布于熱帶和亞熱帶地區(qū)的世界性農(nóng)業(yè)害蟲。該蟲寄主范圍廣、適應能力強、繁殖力高且擴散能力強，是國際貿(mào)易的技術壁壘，被許多國家列為檢疫對象。桔小實蠅產(chǎn)卵于果實內(nèi)，幼蟲潛居于果瓤中取食危害，導致果實腐爛、未熟先落，降低果蔬的經(jīng)濟價值和食用價值。目前，由于化學藥劑的不科學使用，桔小實蠅對多種常用殺蟲劑產(chǎn)生嚴重的抗藥性。

2、因此，亟待尋找新的殺蟲劑作用靶標或研發(fā)綠色防控技術。昆蟲胰島素信號的轉(zhuǎn)導能夠調(diào)節(jié)機體的生長發(fā)育、代謝、生殖以及衰老等重要生理過程。因此，闡明桔小實蠅胰島素信號通路調(diào)控其變態(tài)發(fā)育的分子機制，可為尋找殺蟲劑新的作用靶標提供理論基礎。
　　本學位論文以桔小實蠅為研究對象，利用RT-qPCR技術分析胰島素信號通路7個重要基因在桔小實蠅各生長發(fā)育時期和體段或組織中的表達模式；分析這些基因在20E和饑餓脅迫后的應激表達模式；利用RNAi技術解

3、析這些基因的功能；最后，利用HPLC技術檢測沉默桔小實蠅BdFoxO后對其體內(nèi)蛻皮激素滴度的影響，進一步闡明胰島素信號通路基因與蛻皮激素間的關聯(lián)。研究結(jié)果將明確這些基因的功能以及調(diào)控方式，為桔小實蠅的持續(xù)防控提供新的思路和方法。主要研究結(jié)果如下：
　　1.桔小實蠅胰島素信號通路3個基因的時空表達模式分析
　　1.1 桔小實蠅胰島素信號通路3個基因在各發(fā)育時期的表達模式
　　利用RT-qPCR技術解析胰島素信號通路3個重

4、要基因（BdFoxO、BdFBP、BdPEPCK）在桔小實蠅的各發(fā)育時期的mRNA表達模式。結(jié)果表明，BdFoxO在幼蟲及蛹期的相對表達量較高，且最高表達量出現(xiàn)在幼蟲孵化后的第1天；BdFBP在幼蟲階段的相對表達量較高，其余發(fā)育時期間差異不顯著；BdPEPCK在蛹期相對表達量較高，成蟲羽化后第1天的表達量最高。結(jié)合前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)大多數(shù)胰島素信號通路基因在桔小實蠅幼蟲及蛹期的相對表達量較高，說明這些基因參與調(diào)控桔小實蠅的蛻皮過程。

5、>　　1.2 桔小實蠅胰島素信號通路3個基因在不同體段或組織中的表達模式
　　利用RT-qPCR技術解析胰島素信號通路3個重要基因（BdFoxO、BdFBP、BdPEPCK）在桔小實蠅頭部、胸部、腹部、卵巢、馬氏管、脂肪體及中腸7個不同體段或組織中的mRNA表達模式。結(jié)果表明，BdFoxO在中腸相對表達量最高，其后為脂肪體。BdFBP和BdPEPCK在脂肪體中表達量最高，且BdPEPCK在脂肪體的表達量是卵巢表達量的102.1倍。

6、脂肪體能夠整合多種營養(yǎng)和激素信號調(diào)控昆蟲個體和細胞大小，胰島素信號通路基因在桔小實蠅脂肪體相對較高水平的表達進一步說明這些基因可能影響其生長發(fā)育過程。
　　2.20E和饑餓處理對桔小實蠅胰島素信號通路7個基因表達的影響
　　2.1 20E處理對桔小實蠅胰島素信號通路7個基因表達的影響
　　利用微量注射法，對桔小實蠅第5日齡幼蟲注射不同劑量的20E，通過
　　RT-qPCR技術檢測胰島素信號通路7個基因（Akt、P

7、DK、PI3K21B、InR、BdFoxO、BdFBP以及BdPEPCK）的相對表達量。結(jié)果表明，除Akt在20E處理后相對表達水平顯著下調(diào)外，其余6個基因總體呈顯著上調(diào)趨勢。說明在外源激素的刺激下，昆蟲體內(nèi)胰島素信號通路基因轉(zhuǎn)錄水平出現(xiàn)相應調(diào)節(jié)變化，使體內(nèi)各激素間達到動態(tài)平衡，從而維持自身體內(nèi)的穩(wěn)定。
　　2.2 饑餓處理對桔小實蠅胰島素信號通路7個基因表達的影響
　　利用RT-qPCR技術解析桔小實蠅胰島素信號通路7個基

8、因在饑餓處理后的表達水平變化。結(jié)果表明，除Akt及BdFBP在饑餓處理后顯著下調(diào)外，其余多數(shù)基因的表達顯著上調(diào)。推測桔小實蠅幼蟲在受到饑餓脅迫后，可能通過胰島素信號通路基因間轉(zhuǎn)錄水平的相互協(xié)調(diào)加強體內(nèi)信號轉(zhuǎn)導，從而避免不良環(huán)境對自身種群延續(xù)產(chǎn)生的威脅。
　　3.桔小實蠅胰島素信號通路7個基因的功能初探
　　通過體外轉(zhuǎn)錄法獲得高質(zhì)量dsRNA，借助微量注射法將外源dsRNA導入桔小實蠅4日齡幼蟲體內(nèi)。RT-qPCR分析結(jié)果表明

9、，7個基因48h后沉默效率均在50％左右，沉默效率最高的在80%以上。分別檢測7個胰島素信號通路基因的表達水平，發(fā)現(xiàn)7個基因相互之間存在不同程度的影響，說明這些基因之間可能存在一系列反饋與負反饋調(diào)節(jié)機制。沉默后對蟲體進行表型觀察，發(fā)現(xiàn)大多胰島素信號通路基因沉默后對其幼蟲化蛹時間產(chǎn)生一定的影響，推測與胰島素信號通路的基因沉默導致桔小實蠅發(fā)生某些生理變化有關。通過對注射dsBdFoxO的幼蟲進一步觀察發(fā)現(xiàn)，沉默BdFoxO的幼蟲體重明顯變重