Akt基因治療肝硬化門靜脈高壓癥的實驗研究.pdf

1、目的：肝內(nèi)血管阻力增加是門靜脈高壓癥發(fā)病病理生理機制的始動原因，也是導(dǎo)致肝硬化病人并發(fā)癥和死亡的主要原因，其阻力增加主要是肝纖維沉積和再生結(jié)節(jié)形成引起肝解剖結(jié)構(gòu)異常的結(jié)果。然而近年研究已經(jīng)確定增加的肝內(nèi)阻力并非全是一種機械現(xiàn)象，不同的血管活性物質(zhì)如NO等在肝硬化門靜脈高壓癥肝內(nèi)阻力的發(fā)展中起重要作用；實驗研究業(yè)已證實在肝硬化肝內(nèi)eNOS酶活性下調(diào)和NO合成產(chǎn)量減少，繼而進(jìn)一步增加肝內(nèi)血管阻力。實驗證實絲蘇氨酸激酶Akt是eNOS酶上游重

2、要的激活劑，但其在肝硬化門靜脈高壓癥中的潛在作用尚不清楚。因此，本實驗的目的是檢測研究在肝硬化時肝內(nèi)是否存在Akt活化受損，以及這一現(xiàn)象與門靜脈高壓癥相關(guān)的NO合成產(chǎn)量減少有著怎樣的關(guān)系。 方法：采用四氯化碳（CCl4）復(fù)合法誘導(dǎo)制備SD大鼠肝硬化實驗動物模型；應(yīng)用AdMax系統(tǒng)，以細(xì)胞內(nèi)同源重組構(gòu)建攜帶目的基因活化Akt的重組復(fù)制缺陷型腺病毒載體（Ad-myr-Akt）；以編碼myr-Akt或EGFP的重組腺病毒轉(zhuǎn)移方法研究蛋

3、白激酶Akt在肝硬化實驗大鼠肝內(nèi)的作用效應(yīng)；Westernblot法檢測肝組織Akt和eNOS蛋白含量和磷酸化狀態(tài)；硝酸還原酶法檢測肝組織NO含量；多普勒超聲測定實驗大鼠門靜脈內(nèi)徑、最大流速和流量，置管測定門靜脈壓力（PP）、平均動脈壓（MAP）和心率（HR）；采用LX20生化自動分析儀檢測肝酶學(xué)指標(biāo)及血清白蛋白；HE染色切片做組織學(xué)檢查；熒光顯微鏡觀察并檢測EGFP的表達(dá)強度。 結(jié)果： 1、本研究成功制備64只SD大鼠

4、肝硬化實驗?zāi)Ｐ秃统晒?gòu)建攜帶myr-Akt基因滴度為5.5×1011vp/ml的新型重組腺病毒（Ad-myr-Akt）。 2、肝硬化實驗動物模型肝內(nèi)顯示Akt和eNOS蛋白表達(dá)與正常大鼠一致，但p-Akt和p-eNOS蛋白表達(dá)均顯著下調(diào)（即Akt和eNOS酶磷酸化受損）。 3、腺病毒載體介導(dǎo)的myr-Akt（Ad-myr-Akt）基因轉(zhuǎn)移實驗顯示肝硬化大鼠肝內(nèi)eNOS酶活性恢復(fù)和NO產(chǎn)量增加，3天后即檢測到實驗大鼠門靜脈

5、壓力的恢復(fù)和改善其血流動力；與此對照，編碼EGFP的腺病毒Ad-EGFP轉(zhuǎn)入或生理鹽水注射的實驗大鼠肝內(nèi)未產(chǎn)生任何類似效應(yīng)。 4、Ad-myr-Akt具有高度的肝靶向性，經(jīng)靜脈途徑注入可在實驗大鼠肝內(nèi)有效表達(dá)，且在30天內(nèi)仍可見到這種效應(yīng)。 5、與注入生理鹽水的肝硬化大鼠比較，轉(zhuǎn)入編碼myr-Akt基因或EGFP的腺病毒肝硬化大鼠未見ALB、ALT和AST的顯著升高；腺病毒載體Ad-5可導(dǎo)致正常大鼠輕微的肝損害，表現(xiàn)為肝

6、酶學(xué)指標(biāo)（ALT和AST）一過性升高；myr-Akt基因轉(zhuǎn)移方法改善CCl4延長誘導(dǎo)的肝硬化大鼠30天生存率。 結(jié)論：肝硬化大鼠肝內(nèi)Akt蛋白活化作用受損；經(jīng)靜脈途徑注射編碼myr-Akt基因片段的重組腺病毒Ad-myr-Akt能在實驗大鼠肝內(nèi)有效表達(dá)Akt蛋白；Akt基因轉(zhuǎn)移方法能恢復(fù)肝硬化動物肝內(nèi)e-NOS酶活性和增加肝內(nèi)NO產(chǎn)量，繼而使門靜脈壓力恢復(fù)正常和改善門靜脈血流動力。綜上所有數(shù)據(jù)提示Akt基因轉(zhuǎn)移方法可能成為未來臨