體外侵襲實(shí)驗(yàn)分離高侵襲性和低侵襲性腎癌細(xì)胞.pdf

1、腎細(xì)胞癌，是泌尿系統(tǒng)常見腫瘤，浸潤(rùn)生長(zhǎng)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是晚期腎癌的重要特征，近1/3的腎癌患者首診時(shí)已屬晚期，預(yù)后極差。腎透明細(xì)胞癌是腎細(xì)胞癌中最常見的病理類型，約占70％～80％[1]，因此篩選和鑒定腎透明細(xì)胞癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因，尋找一與轉(zhuǎn)移相關(guān)的生物學(xué)標(biāo)志物，用于早期發(fā)現(xiàn)腎癌轉(zhuǎn)移，對(duì)降低腎癌死亡率具有重要意義。而建立具有相同遺傳背景的高、低轉(zhuǎn)移性細(xì)胞株是尋找和篩選轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的基礎(chǔ)和關(guān)鍵。腫瘤轉(zhuǎn)移異質(zhì)性理論認(rèn)為，在腫瘤組織中存在著具有不同侵襲

2、、轉(zhuǎn)移能力的細(xì)胞亞群，而只有那些具有完成侵襲轉(zhuǎn)移全過程能力如粘附能力、蛋白水解能力、細(xì)胞游走能力的瘤細(xì)胞才能最終形成轉(zhuǎn)移灶。因此可依據(jù)某些侵襲、轉(zhuǎn)移有關(guān)因素的表達(dá)與否篩選出具有不同侵襲轉(zhuǎn)移能力的瘤細(xì)胞。 Matrigel膠是一種從EHS(Engelbreth-Holm-Swarm)小鼠肉瘤中提取的可溶性基底膜成分。主要由層粘連蛋白、IV型膠原蛋白、硫酸乙酞肝素糖蛋白(類肝素蛋白多糖)、纖維連接蛋白等組成。室溫下Matrigel膠

3、聚合成一種具有生物學(xué)活性的基質(zhì)材料，在聚碳酸濾膜上形成一膠凍狀物，封閉聚碳酸濾膜上的小孔，作用與哺乳動(dòng)物細(xì)胞基底膜類似，只有那些具有蛋白水解能力的腫瘤細(xì)胞才能穿過聚碳酸濾膜上的小孔，無蛋白水解能力的非侵襲性細(xì)胞不能穿過。因此Matrigel膠可用于體外分離不同侵襲性腫瘤細(xì)胞。本研究擬構(gòu)建侵襲小室，用于體外分離高侵襲性和低侵襲性腎癌細(xì)胞。分別從高侵襲性腎癌細(xì)胞和低侵襲性腎癌細(xì)胞中提取總RNA，并利用SMART。技術(shù)將RNA轉(zhuǎn)化成cDNA，

4、為進(jìn)一步抑制性消減雜交打下基礎(chǔ)?！　∧康模汉Y選相同背景來源的高侵襲性和低侵襲性腎細(xì)胞癌細(xì)胞，對(duì)比二者差異。提取高、低侵襲性腎癌細(xì)胞的總RNA，并轉(zhuǎn)化為cDNA，為研究腎細(xì)胞癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因打下基礎(chǔ)。 方法：對(duì)腎癌細(xì)胞株ACHN進(jìn)行傳代培養(yǎng)。在預(yù)實(shí)驗(yàn)確定鋪膠濃度、消化回收時(shí)間的基礎(chǔ)上，采用涂有Matrigel膠的Transwell對(duì)傳代培養(yǎng)的腎癌細(xì)胞進(jìn)行體外侵襲實(shí)驗(yàn)，分離回收高侵襲性和低侵襲性腎癌細(xì)胞。分別從高侵襲性腎癌細(xì)胞與低侵

5、襲性腎癌細(xì)胞中提取總RNA,并利用SMART技術(shù)將RNA轉(zhuǎn)化成cDNA。 結(jié)果：以濃度為1.17mg/ml、20μl/孔鋪膠在。Transwell，固定細(xì)胞懸液密度(5×106/ml)，第48小時(shí)消化回收細(xì)胞較為理想。非侵襲性細(xì)胞呈散在生長(zhǎng)，侵襲性細(xì)胞多呈聚集樣生長(zhǎng)，成功分離高侵襲性和低侵襲性腎癌細(xì)胞。從高侵襲性腎癌細(xì)胞與低侵襲性腎癌細(xì)胞提取的RNA經(jīng)變性甲醛/瓊脂糖凝膠電泳分析表明完整性和純度良好，SMART。技術(shù)可以利用微量