苦參堿聚乳酸微球防治增殖性玻璃體視網(wǎng)膜病變的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、增殖性玻璃體視網(wǎng)膜病變(proliferative vitreoretinopathy，PVR)是眼科常見的嚴(yán)重影響視功能的疾病之一，是視網(wǎng)膜脫離(retinal detachment，RD)的嚴(yán)重并發(fā)癥和視網(wǎng)膜復(fù)位術(shù)失敗的主要原因，是細(xì)胞性膜在玻璃體腔及視網(wǎng)膜內(nèi)外表面形成和收縮導(dǎo)致牽引性視網(wǎng)膜脫離的一類病變。PVR的治療困難，目前臨床常用治療手段為外科手術(shù)，但術(shù)后視功能恢復(fù)不理想，復(fù)發(fā)率也較高，所以藥物治療PVR成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者們?nèi)找骊P(guān)

2、注的熱點(diǎn)。但PVR具有復(fù)雜的發(fā)病機(jī)制和緩慢的病理過程，藥物應(yīng)能夠從不同環(huán)節(jié)發(fā)揮作用，而且藥物的作用時(shí)間必須足夠長(zhǎng)，才能夠滿足治療的需要。迄今為止尚無(wú)臨床可用的安全有效的防治PVR的藥物。苦參堿(matrine)作為一種中藥單體成分，其顯著的抗增殖抗纖維化功能和類似于糖皮質(zhì)激素樣的直接抗炎作用已被證實(shí)，可以推測(cè)其在PVR的防治方面也應(yīng)有上佳表現(xiàn)，如果制成緩釋劑型，延長(zhǎng)了藥物作用時(shí)間，其防治效果會(huì)更加令人滿意。本課題意在探討研究苦參堿聚乳酸

3、微球(matrine polyactic acid microsphere，MAT-PLA-MS)緩釋系統(tǒng)體內(nèi)外的緩釋效果、在防治實(shí)驗(yàn)性PVR中的安全性及所發(fā)揮的作用。 第一部分苦參堿聚乳酸微球體外釋放及玻璃體腔注射的安全性研究 目的: 游離藥物半衰期短，為了延長(zhǎng)苦參堿在玻璃體腔的作用時(shí)間，充分發(fā)揮藥物的治療作用，制備了其緩釋系統(tǒng)苦參堿聚乳酸微球(matrine polyactic acid microsphere,MA

4、T-PLA-MS)。本部分考量此長(zhǎng)效劑型在體外的緩釋性，同時(shí)觀察其在玻璃體腔注射的安全性，尋找最大安全劑量。 方法: 1.采用光學(xué)顯微鏡和透射電子顯微鏡觀察MAT-PLA-MS的外觀形態(tài)，粒度分析儀測(cè)量其粒徑。 2.采用高效液相色譜分析(high-performance liquid chromatography,HPLC)測(cè)定MAT-PLA-MS載藥量，紫外分光光度法計(jì)算釋藥量及累積釋放百分率。3.將40只實(shí)驗(yàn)

5、動(dòng)物隨機(jī)分為四組：第一組：玻璃體腔注射游離苦參堿生理鹽水溶液0.3ml(含苦參堿4mg)，10只兔20只眼；第二組：玻璃體腔注射載藥微球生理鹽水懸液0.3ml(含苦參堿4mg)，10只兔20只眼；第三組：玻璃體腔注射載藥微球生理鹽水懸液0.3ml(含苦參堿6mg)，10只兔20只眼；第四組：對(duì)照組10只兔，左眼注入生理鹽水0.3ml(10只眼)，右眼注入空白聚乳酸微球(blank polyactic acid microsphere，b

6、lank-PLA-MS)懸液0.3ml(10只眼)。玻璃體腔注射前均穿刺抽取玻璃體0.3ml。注藥后第1、3、7、14、21、28天以裂隙燈顯微鏡觀察角膜、房水、晶狀體是否清亮，前節(jié)炎癥反應(yīng)情況；間接檢眼鏡觀察玻璃體炎癥反應(yīng)情況；視網(wǎng)膜電圖(electroretinogram，ERG)檢查視網(wǎng)膜功能損害的情況；注藥后第1、7、14、28天，從各組中分別取2只實(shí)驗(yàn)用兔進(jìn)行組織學(xué)檢查(光學(xué)顯微鏡和透射電子顯微鏡)，觀察視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)的改變，

7、以評(píng)價(jià)藥物的毒副作用。第二、三組(載藥微球組)給藥后1、3、7、14、21、28天行眼前節(jié)及眼底彩色照相，觀察載藥微球在玻璃體腔內(nèi)的分解過程。 結(jié)果: 1.制備的苦參堿聚乳酸微球?yàn)榉勰畎咨腆w，微球分散性良好，粒徑大小較均勻，表面光滑、致密，球形圓整、規(guī)則。粒度分析儀測(cè)量其平均粒徑為2.28μm。 2.高效液相色譜法測(cè)得載藥量為6.17％。體外釋放672h，累積釋放百分率為87.93％。 3.各實(shí)驗(yàn)組和

8、對(duì)照組動(dòng)物在玻璃體腔注藥后的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，裂隙燈顯微鏡可見角膜、房水、晶狀體透明，前節(jié)無(wú)明顯炎癥反應(yīng)，間接檢眼鏡檢查玻璃體及眼底未見異常表現(xiàn)。載藥微球各組家兔隨觀察時(shí)間延長(zhǎng)，玻璃體腔內(nèi)微球表現(xiàn)為逐漸彌散、降解、減少，最后接近消失，玻璃體腔不遺留增殖、混濁等改變。所有對(duì)照眼在玻璃體腔注射生理鹽水或空白微球懸液后的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，ERG最大反應(yīng)a、b波振幅與注射前相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。游離藥物4mg組在注藥后1、3、7、14、21、28天a、b波

9、振幅均下降，與注藥前相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。載藥微球(含苦參堿4mg)組a、b波振幅與注射前相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。載藥微球(含苦參堿6mg)組a波振幅從注藥后14天開始下降，與注藥前相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；b波振幅在各時(shí)間點(diǎn)與注射前相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組動(dòng)物在玻璃體腔注射后的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)在光鏡下均未見異常。透射電鏡下，游離藥物4mg組在注藥后1天出現(xiàn)視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(retinal pigment epit

10、helialcells，RPE細(xì)胞)微絨毛稀疏、變短，與視細(xì)胞外節(jié)的包繞關(guān)系消失，外節(jié)排列及膜盤結(jié)構(gòu)紊亂。7天出現(xiàn)外核層胞漿水腫，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕度擴(kuò)張，müller細(xì)胞水腫。14天及28天時(shí)仍可見到上述改變。載藥微球6mg組在注藥后7天、14天、28天可觀察到視細(xì)胞內(nèi)、外節(jié)間隙增大，但膜盤結(jié)構(gòu)清楚。其余各組視網(wǎng)膜超微結(jié)構(gòu)在各時(shí)間點(diǎn)均未見到異常表現(xiàn)。 結(jié)論: 苦參堿聚乳酸微球體外釋放672h，累積釋放百分率為87.93％，具有

11、良好的緩釋性。苦參堿聚乳酸微球(含苦參堿4mg)注入兔眼玻璃體腔是安全的，而游離苦參堿4mg則損害視網(wǎng)膜功能，藥物緩釋系統(tǒng)(drug delivery system,DDS)提高了藥物的非毒性劑量。 第二部分苦參堿聚乳酸微球玻璃體腔內(nèi)注射的藥代動(dòng)力學(xué)的實(shí)驗(yàn)研究 目的: 藥物防治增殖性玻璃體視網(wǎng)膜病變的效果有賴于藥物的作用時(shí)間。本部分針對(duì)藥物緩釋系統(tǒng)進(jìn)行玻璃體腔內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)研究，觀察苦參堿聚乳酸微球在玻璃體腔維持有效治療

12、濃度的時(shí)間，定量研究其在眼內(nèi)的緩釋特性。 方法: 將實(shí)驗(yàn)用兔隨機(jī)分為標(biāo)準(zhǔn)及質(zhì)控組3只兔(6只眼)，實(shí)驗(yàn)組27只兔(54只眼)。實(shí)驗(yàn)組再隨機(jī)分為9組，每組3只兔6只眼。標(biāo)準(zhǔn)及質(zhì)控組動(dòng)物無(wú)需手術(shù)操作，實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物穿刺抽取玻璃體0.3ml后玻璃體腔注入苦參堿聚乳酸微球(含苦參堿4mg)混懸液0.3ml。注藥后，在以下9個(gè)時(shí)間點(diǎn)10min、2h、1d、3d、7d、14d、21d、28d、35d分別摘除9組實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物雙眼眼球并制備玻璃體待檢

13、樣品。應(yīng)用高效液相色譜技術(shù)檢測(cè)玻璃體腔藥物濃度，并對(duì)該技術(shù)檢測(cè)玻璃體樣品的方法學(xué)進(jìn)行研究。用DAS軟件計(jì)算主要的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。 結(jié)果: 在本研究采用的玻璃體樣品的處理和檢測(cè)方法下，苦參堿與玻璃體內(nèi)源性物質(zhì)二者的色譜峰分離良好，苦參堿的保留時(shí)間為5.4 min。用此種方法檢測(cè)苦參堿在玻璃體內(nèi)的濃度具有很好的特異性?？鄥A在玻璃體內(nèi)穩(wěn)定存在，沒有檢測(cè)到代謝峰。玻璃體內(nèi)苦參堿濃度在6.56μg/ml-210μg/ml范圍內(nèi)呈線性關(guān)系

14、?？鄥A在玻璃體中的提取回收率較高，準(zhǔn)確性好，檢測(cè)方法的日內(nèi)和日間變異較小，精密度高，方法的最低檢測(cè)濃度較小，為1.01μg/ml，靈敏度高。玻璃體腔注入苦參堿聚乳酸微球(含苦參堿4mg)，藥物在玻璃體內(nèi)的平均滯留時(shí)間MRT=221.64±9.70h，半衰期t1/2=173.77±32.33h。緩釋微球在玻璃體腔釋藥可達(dá)840h以上，840h的藥物濃度為121.8±34.6μg/ml。緩釋微球注入玻璃體腔后1d、3d、7d、14d、21

15、d、28d、35d(840h)，微球中苦參堿的總體清除率(total clearance rate，TCR)分別為17.65％、32.05％、51.31％、73.98％、85.71％、92.63％、96.41％，隨時(shí)間延長(zhǎng)，排出率穩(wěn)定增加。 結(jié)論: 玻璃體腔注入苦參堿聚乳酸微球(含苦參堿4mg)，藥物在眼內(nèi)清除較慢，清除時(shí)間明顯延長(zhǎng)，在玻璃體腔內(nèi)能夠長(zhǎng)時(shí)間維持較高的濃度，表現(xiàn)出良好的體內(nèi)緩釋性。 第三部分苦參堿聚乳酸微球

16、防治實(shí)驗(yàn)性增殖性玻璃體視網(wǎng)膜病變的效果研究 目的: 從苦參堿己知的藥理作用可以推測(cè)其對(duì)增殖性玻璃體視網(wǎng)膜病變的防治有效。前期的系列研究已經(jīng)證實(shí)了其對(duì)體外血清誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的增殖有較強(qiáng)的抑制作用，本部分探討苦參堿聚乳酸微球在動(dòng)物體內(nèi)抑制實(shí)驗(yàn)性PVR的效果。 方法: 向30只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物玻璃體腔中后部注入2×105個(gè)/0.1ml的同種異體成纖維細(xì)胞懸液，制備PVR模型。將其隨機(jī)分為三組：第一組：玻璃體腔注入載藥微球(含

17、苦參堿4mg)生理鹽水混懸液0.3ml，10只兔20只眼；第二組：注入游離苦參堿(2mg)生理鹽水溶液0.3ml，10只兔20只眼；第三組：對(duì)照組10只兔，左眼注入生理鹽水0.3ml(10只眼)，右眼注入空白微球懸液(10只眼)0.3ml。玻璃體腔注射前均穿刺抽取玻璃體0.3ml。所有動(dòng)物玻璃體腔手術(shù)操作后第1、3、7、14、21、28、35天用裂隙燈顯微鏡觀察角膜、房水、晶狀體是否清亮，前節(jié)炎癥反應(yīng)情況；用間接檢眼鏡、眼底彩色照相和B