突變型PUMA對(duì)Hela細(xì)胞生物學(xué)功能的影響及其分子機(jī)制.pdf

1、p53上調(diào)凋亡調(diào)制物(p53 upregulated modulator of apoptosis，PUMA)是一個(gè)具有強(qiáng)大促凋亡能力的BH3-only家族蛋白質(zhì)基因。PUMA通常低表達(dá)，但PUMA在許多病理性應(yīng)激因素可以通過一些轉(zhuǎn)錄因子(如p53、p73、E2F1和FOXO3a)上調(diào)其表達(dá)，借此誘導(dǎo)凋亡的反應(yīng)。近兩年研究發(fā)現(xiàn)一個(gè)新穎的調(diào)控機(jī)制:PUMA翻譯后調(diào)控。轉(zhuǎn)錄體PUMA-α編碼一個(gè)全長(zhǎng)為193個(gè)氨基酸的蛋白，其中10號(hào)位絲氨酸

2、是最重要的磷酸化位點(diǎn)。當(dāng)10號(hào)位絲氨酸被丙氨酸取代可以減慢PUMA的降解、延長(zhǎng)其半衰期、增加其穩(wěn)定性、增強(qiáng)細(xì)胞凋亡的能力。
　　本課題旨在探討針對(duì)PUMA蛋白10號(hào)位磷酸化位點(diǎn)突變的突變型與野生型PUMA蛋白對(duì)腫瘤細(xì)胞功能方面的差異及其可能的作用機(jī)制，為以后尋找更多PUMA蛋白翻譯后調(diào)控機(jī)制梁奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　目的:
　　觀察突變型PUMA與野生型PUMA對(duì)腫瘤細(xì)胞生物學(xué)功能方面的差異，并探討其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制

3、，此為深入研究PUMA基因的抑癌功能及其翻譯后調(diào)節(jié)奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　方法:
　　通過PCR方法從pCEP4-(HA)2-PUMA質(zhì)粒中擴(kuò)增PUMA基因，并克隆到pIRES2-EGFP載體上，構(gòu)建PUMA真核表達(dá)載體pIRES2-EGFP-(HA)2-PUMA，利用定點(diǎn)突變技術(shù)構(gòu)建pIRES2-EGFP-(HA)2-PUMA-T28G質(zhì)粒，行PCR及測(cè)序鑒定;脂質(zhì)體分別將兩種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞，RT-PCR檢測(cè)PUMA的表

4、達(dá)，Western blot檢測(cè)突變型PUMA蛋白和標(biāo)簽蛋白的表達(dá)。
　　實(shí)驗(yàn)隨機(jī)分為(1)空載質(zhì)粒組(2)野生型PUMA組(3)突變型PUMA組，應(yīng)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法分別將空載質(zhì)粒、野生型PUMA質(zhì)粒、突變型PUMA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人宮頸癌細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染24h及48h后用RT-PCR和Western blot方法檢測(cè)各組PUMA表達(dá)情況;MTT及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)野生型PUMA與突變型PUMA對(duì)細(xì)胞增殖抑制和促凋亡作用;應(yīng)用PI及Hoechs

5、t33342核染法觀察野生型PUMA與突變型PUMA對(duì)細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)改變;野生型實(shí)驗(yàn)組和突變型實(shí)驗(yàn)組分別加入蛋白質(zhì)合成抑制劑放線菌酮后，Western blot方法檢測(cè)PUMA蛋白的表達(dá)變化情況;RT-PCR方法檢測(cè)PUMA及凋亡相關(guān)基因BAX、BCL-2的mRNA的表達(dá)變化;分光光度法檢測(cè)細(xì)胞的Caspase-3活性變化。
　　結(jié)果:
　　經(jīng)PCR及測(cè)序結(jié)果表明，正確構(gòu)建野生型、突變型PUMA重組質(zhì)粒，PUMA基因第10

6、位氨基酸的第28～30位堿基由TCC突變?yōu)镚CC，其他堿基均無突變。野生型、突變型PUMA重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞熒光顯微鏡觀察到綠色熒光表達(dá)。Western blot和RT-PCR均檢測(cè)出目的基因的高表達(dá)。提示PUMA基因及其定點(diǎn)突變載體均構(gòu)建成功。
　　在相同轉(zhuǎn)染效率的情況下，通過Western blot分析野生型PUMA組和突變型PUMA組的表達(dá)水平，結(jié)果表明突變型PUMA蛋白比野生型PUMA蛋白有一個(gè)更高的穩(wěn)定狀態(tài)。在表達(dá)

7、野生型和突變的PUMA細(xì)胞中我們通過實(shí)時(shí)定量PCR測(cè)量出同等量的PUMA mRNA，表明并不是由于轉(zhuǎn)染效率或不同的轉(zhuǎn)錄率導(dǎo)致的這種差異;接下來在轉(zhuǎn)染24h后誘導(dǎo)表達(dá)野生型和突變型的PUMA細(xì)胞中均加入蛋白質(zhì)合成抑制劑放線菌酮，然后對(duì)PUMA蛋白的降解進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，由于我們改變了PUMA蛋白的磷酸化位點(diǎn)，導(dǎo)致突變型PUMA蛋白降解延遲、半衰期延長(zhǎng)，提示10號(hào)位絲氨酸磷酸化在決定PUMA降解率上具有重要的作用;野生型PUMA質(zhì)粒、突變

8、型PUMA質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞，在24、48小時(shí)后測(cè)定光密度值，結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞轉(zhuǎn)染兩種質(zhì)粒后，細(xì)胞存活率隨著時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸下降，且轉(zhuǎn)染突變型PUMA質(zhì)粒在24、48小時(shí)的存活率均比野生型PUMA質(zhì)粒組低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，這表明突變型PUMA對(duì)Hela細(xì)胞抑制增殖作用優(yōu)于野生型PUMA;通過PI及Hoechst33342染色后評(píng)價(jià)細(xì)胞核型，計(jì)算被轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的早期和晚期凋亡細(xì)胞數(shù)。轉(zhuǎn)染24h后，轉(zhuǎn)染突變型PUMA組在GF

9、P陽性細(xì)胞中有22.5％的細(xì)胞出現(xiàn)凋亡，空載體組只有11.8％，相比轉(zhuǎn)染野生型PUMA組細(xì)胞中增加了約9.2％的細(xì)胞凋亡，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。而隨著轉(zhuǎn)染PUMA在細(xì)胞中表達(dá)時(shí)間的延長(zhǎng)，48h后突變型PUMA組比轉(zhuǎn)染野生型PUMA組細(xì)胞凋亡增加了約9.5％，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著PUMA轉(zhuǎn)染時(shí)間的增加，野生型和突變型兩組腫瘤細(xì)胞的凋亡率均逐漸升高，并且突變型組細(xì)胞比野生型組細(xì)胞的凋亡率增加

10、更加明顯，這與核染色結(jié)果相似。
　　轉(zhuǎn)染突變型PUMA質(zhì)粒作用Hela細(xì)胞，在0、6、12、24、36、48小時(shí)，通過RT-PCR法檢測(cè)BCL-2和BAX表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，在PUMA表達(dá)逐漸增加的同時(shí)，BCL-2表達(dá)逐漸減少，而BAX表達(dá)無明顯變化。PUMA表達(dá)在48小時(shí)達(dá)到最高點(diǎn)，而BCL-2表達(dá)在48小時(shí)降低到最低點(diǎn)，不同時(shí)間點(diǎn)的PUMA和BCL-2表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05).提示PUMA轉(zhuǎn)染細(xì)胞后降低

11、了BCL-2的活性，而PUMA對(duì)細(xì)胞內(nèi)BAX總量沒有明顯影響(P=0.060)。檢測(cè)Caspase-3各個(gè)時(shí)間組活性變化結(jié)果表明，在轉(zhuǎn)染突變型PUMA作用后，Caspase-3活性顯著升高，轉(zhuǎn)染6h組是0h組的(1.23±0.23)倍，轉(zhuǎn)染12h組是0h組的(2.05±0.17)倍，轉(zhuǎn)染24h組是0h組的(2.75±0.22)倍，轉(zhuǎn)染36h組是0h組的(3.32±0.24)倍，48h達(dá)到最高程度，是0h組的(4.21±0.21)倍，各組

12、與0h組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1、PUMA具有抑制Hela腫瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)其凋亡的作用，并且突變型比野生型PUMA對(duì)Hela腫瘤細(xì)胞的抑制作用及促凋亡功能更加明顯。
　　2、PUMA10號(hào)位點(diǎn)的絲氨酸是重要的磷酸化位點(diǎn)，絲氨酸被丙氨酸取代后增加了PUMA穩(wěn)定性，減慢了其降解、延長(zhǎng)了其半衰期。
　　3、PUMA對(duì)Hela腫瘤細(xì)胞的促凋亡作用，是通過調(diào)控抗凋亡BCL-2表達(dá)，最終導(dǎo)