重組瘦素基因?qū)撬杌|(zhì)細(xì)胞增殖分化的影響.pdf

1、目的： 構(gòu)建重組瘦素基因(Leptin)真核表達(dá)質(zhì)粒pTraceTM-Leptin；轉(zhuǎn)染SD大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞(marrow stromal cell，MSCs)，研究Leptin基因?qū)SCs增殖分化的影響。 方法： 提取人脂肪組織總RNA，根據(jù)GeneBank公布的Leptin基因序列設(shè)計(jì)合成一對(duì)引物，采用RT-PCR技術(shù)克隆Leptin基因，酶切后重組到帶有GFP標(biāo)記的pTracerTM-CMV/Bsd載體上

2、，構(gòu)建重組基因真核質(zhì)粒pTracerTM-Leptin。采用密度梯度離心法體外獲得SD大鼠的骨髓基質(zhì)細(xì)胞，將重組真核質(zhì)粒pTracerTM-Leptin通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染骨髓基質(zhì)細(xì)胞，以抗生素Blasticidin加壓篩選獲得Leptin基因修飾的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株，普通光鏡及熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)基因細(xì)胞形態(tài)，采用分子生物學(xué)法(RT-PCR法)和免疫學(xué)法(Western blot法)分別從mRNA水平和蛋白質(zhì)水平檢測(cè)目的基因在轉(zhuǎn)基因細(xì)胞中的轉(zhuǎn)

3、錄和翻譯，MTT法檢測(cè)Leptin基因?qū)SCs的生長(zhǎng)增殖情況，ELISA法檢測(cè)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞上清骨鈣素(OC)分泌水平，并采用對(duì)硝基苯磷酸鹽(PNP)試劑盒測(cè)定轉(zhuǎn)基因細(xì)胞堿性磷酸酶(ALP)活力，半定量RT-PCR法檢測(cè)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞中成骨細(xì)胞分化相關(guān)基因Cbfαl和Cbfβ的表達(dá)。 結(jié)果： 成功獲得約450bp的人Leptin基因，PCR、雙酶切及序列測(cè)定結(jié)果顯示成功構(gòu)建了重組基因真核質(zhì)粒pTracerTM-Leptin，并

4、轉(zhuǎn)染密度梯度分離法獲得的大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞，加壓篩選后獲得轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，熒光顯微鏡下可觀察到綠色熒光，并伴有細(xì)胞形態(tài)變化，實(shí)驗(yàn)組的RT-PCR和Western blot結(jié)果均出現(xiàn)目的條帶，表明脂質(zhì)體介導(dǎo)的Leptin基因可以在骨髓基質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)，且促進(jìn)MSCs增殖，并有一定的時(shí)間依賴性，轉(zhuǎn)基因細(xì)胞上清中OC含量增加，ALP活力上調(diào)，成骨細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子Cbfαl和Cbfβ mRNA表達(dá)量也增高。 結(jié)論： 本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了重