轉(zhuǎn)錄后調(diào)控SOD1增加腫瘤細胞放射效應(yīng)影響的研究.pdf

1、目的:目前克服腫瘤細胞放射抗拒性策略較多,但效果欠佳。研究發(fā)現(xiàn)SOD1高表達是腫瘤對放化療抵抗的重要機制之一,但SOD1高表達的機制不明?；虮磉_的精細調(diào)控多與3’UTR的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控有關(guān),但關(guān)于腫瘤SOD1的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控報道較少,因此本課題擬探討腫瘤SOD1轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機制及其對腫瘤反射效應(yīng)的影響,為以SOD1為靶標的放療增敏策略提供理論基礎(chǔ)。
　　方法:本課題主要以卵巢癌細胞系A(chǔ)2780和胰腺癌PANC1為模型,(1)構(gòu)建SOD-3

2、’UTR的熒光素酶報告載體,觀察SOD1、SOD2-3’UTR在腫瘤細胞對熒光素酶活性的影響,以及在過氧化氫和X射線作用下的變化;并應(yīng)用RT-PCR和蛋白印跡法驗證腫瘤細胞在過氧化氫作用下SOD1mRNA和蛋白表達水平的變化。
　　(2)比較SOD1-3’UTR在兩種腫瘤細胞中對熒光素酶活性的影響,并應(yīng)用 RT-PCR法檢測螢火素酶mRNA的水平;并進一步應(yīng)用蛋白印跡法觀察外源SOD-3’UTR對內(nèi)源性SOD蛋白表達的影響。構(gòu)建不

3、同的SOD1-3’UTR熒光素酶報告載體,包括含有不同AREs的、miRNA(miR-224、-377、-621)結(jié)合位點缺失的、單個或多個AREs聯(lián)合缺失的3’UTR載體,或應(yīng)用miRNA的擬似物或抑制劑等觀察RNA元件對3-‘UTR所介導(dǎo)的熒光素酶性的影響,或SOD1蛋白表達的變化。構(gòu)建SOD1-Promoter-SOD1-3’UTR熒光素酶報告載體,進一步對該載體進行AREs缺失突變,檢測X射線處理后熒光素酶活性的變化。
　

4、　(3)RNA干擾技術(shù)下調(diào)AUF1或外源真核表達上調(diào)AUF1,觀察其對SOD1蛋白表達的變化;以及SOD1-3’UTR所介導(dǎo)的熒光素酶活性的變化;并觀察AUF1下調(diào)對腫瘤細胞ROS水平的影響;進一步應(yīng)用RNA免疫共沉淀檢測AUF1與SOD1-3’UTR的直接作用;免疫組化法檢測胰腺癌標本中AUF1和SOD1蛋白的表達。
　　結(jié)果:(1)SOD1、SOD2-3’UTR正義載體與反義載體相比,熒光素酶活性增加近20倍;過氧化氫100μ

5、M明顯增加了A2780細胞內(nèi)SOD1、SOD2-3’UTR所介導(dǎo)的熒光素酶活性;10Gy射線明顯增加了A2780細胞內(nèi)SOD1-3’UTR所介導(dǎo)的熒光素酶活性;過氧化氫100μM增加了A2780細胞SOD1mRNA和蛋白表達水平。
　　(2)在A2780和PANC1細胞內(nèi)SOD1-3’UTR正義載體相比反義、空載體的熒光素酶活性明顯增加;SOD1-3’UTR增加了A2780細胞螢火素酶mRNA的水平;外源SOD-3’UTR降低了A

6、2780細胞內(nèi)源性SOD蛋白的表達,并且外源SOD1-3’UTR能降低內(nèi)源性SOD2蛋白的表達;逐步的對SOD1-3’UTR作片段的截斷后結(jié)果顯示熒光素酶活性也逐漸降低;miR-224,miR-377結(jié)合位點的缺失導(dǎo)致熒光素酶活性顯著下降,而miR-621結(jié)合位點的缺失未見明顯變化;miR-377或miR-621的擬似物或抑制劑并沒有顯著影響內(nèi)源性SOD1的表達,也沒有影響SOD1-3’UTR所介導(dǎo)的熒光素酶活性;任一個ARE的缺失均能

7、降低熒光素酶活性,以ARE6的作用最強;但當載體僅包含2個或4個ARE本身的序列時熒光素酶活性幾乎測不出。ARE6的缺失逆轉(zhuǎn)了X射線誘導(dǎo)的SOD1-Promoter-SOD1-3’UTR所介導(dǎo)的熒光素酶活性的增加。
　　(3)AUF1的下調(diào)明顯降低了SOD1蛋白的表達水平,而HuR的下調(diào)對SOD1蛋白表達的影響不大,并與熒光素酶活性的結(jié)果一致;AUF1的高表達增加了這兩種細胞系內(nèi)的SOD1-3’UTR介導(dǎo)的熒光素酶活性;RT-PC

8、R法僅能從AUF1沉淀物中檢測到SOD1-3’UTR的表達;93例胰腺癌組織標本檢測的結(jié)果顯示AUF1和SOD1的蛋白表達明顯相關(guān)。
　　結(jié)論:(1)SOD1-3’UTR與腫瘤細胞基礎(chǔ)和應(yīng)激狀態(tài)下SOD1的表達相關(guān)。
　　(2)SOD1-3’UTR能增加腫瘤細胞SOD1mRNA的穩(wěn)定性,并與ARE特別是ARE6相關(guān),與所檢測的miRNA結(jié)合位點相關(guān)的可能性不大。
　　(3)AUF1通過與SOD1-3’UTR結(jié)合影響腫瘤