第一部分：人類腸道病毒分子生物學(xué)分型鑒定方法的建立及應(yīng)用;第二部分：乙型肝炎病毒多表位抗原酵母表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建.pdf

1、第一部分人類腸道病毒分子生物學(xué)分型鑒定方法的建立及應(yīng)用。 人類腸道病毒(HEV)是小核糖核酸病毒科的一個(gè)屬，文獻(xiàn)報(bào)道的HEV已有91個(gè)型，分為脊髓灰質(zhì)炎病毒、柯薩奇A組、B組病毒、埃可病毒和新型腸道病毒5個(gè)組。人類腸道病毒感染大多表現(xiàn)為隱性感染或癥狀輕微，但也可以引起無(wú)菌性腦膜炎、弛緩性麻痹、急性心肌炎、手足口病等嚴(yán)重疾病。常規(guī)的HEV鑒定多采用病毒分離結(jié)合中和試驗(yàn)等血清學(xué)方法，由于HEV血清型繁多，血清學(xué)分型鑒定費(fèi)時(shí)費(fèi)力。本研

2、究的目的在于建立人類腸道病毒分子生物學(xué)分型鑒定方法，用于臨床分離腸道病毒的分型鑒定。 根據(jù)已知各型別人類腸道病毒基因的核苷酸序列和文獻(xiàn)資料，分別合成1對(duì)HEV種屬特異性引物“EV1/EV2”和5對(duì)分型鑒定引物“P1/P2”、“P1/P3”、“P4/P7”、“P5/P7”和“P6/P7”，提取病毒RNA，采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)擴(kuò)增病毒cDNA，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳和核苷酸序列分析，建立了人類腸道病毒的分子生物學(xué)分型

3、鑒定方法。采用該方法鑒定了18株疑似HEV毒株，并與血清中和試驗(yàn)相互驗(yàn)證。結(jié)果表明，經(jīng)種屬特異性引物鑒定，其中17株為人類腸道病毒；采用型特異性引物進(jìn)行分型鑒定，其中4株為科薩奇病毒A24型，3株為科薩奇病毒B3型；科薩奇病毒B2、A9、A15型、?？刹《?、6、7、9、11、14、33型和鼻病毒9型各1株，微量中和試驗(yàn)結(jié)果與分子生物學(xué)方法分型結(jié)果完全符合。 本實(shí)驗(yàn)組合運(yùn)用了上述6對(duì)HEV鑒定和分型引物，對(duì)全部引物的PCR擴(kuò)增體

4、系和擴(kuò)增條件進(jìn)行了統(tǒng)一，可以顯著節(jié)約病原學(xué)檢出時(shí)間，同時(shí)可以確定流行株可能發(fā)生的基因變異情況，與傳統(tǒng)的病毒分離和血清學(xué)鑒定分型方法相比具有特異性強(qiáng)、敏感性高、快速簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，可以直接鑒定并分型診斷人類腸道病毒感染，適用于人類腸道病毒感染的實(shí)驗(yàn)室診斷和流行病學(xué)研究。 第二部分乙型肝炎病毒多表位抗原酵母表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建。 慢性乙型肝炎是一種嚴(yán)重的病毒性疾病，雖然近年來(lái)抗HBV治療有了很大進(jìn)展，但由于治療性藥物難以徹底清除乙型肝

5、炎病毒(hepatitisBvirus,HBV)，而且具有停藥易復(fù)發(fā)，易引起病毒變異等缺點(diǎn)，所以打破慢性乙肝患者對(duì)HBV的免疫耐受，提高特異性免疫功能目前被認(rèn)為是有望徹底治愈HBV慢性感染的根本措施。本實(shí)驗(yàn)以HBVHBc作為免疫呈現(xiàn)載體，選取畢赤巴斯德酵母(Pichia.pastoris)外源基因表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)乙型肝炎病毒不同免疫表位嵌合抗原，以期用于治療慢性乙肝患者，增強(qiáng)乙肝病毒各抗原表位的免疫原性和抗原性，打破耐受、重建免疫應(yīng)答，激發(fā)

6、慢性乙肝患者體內(nèi)產(chǎn)生中和抗體和以細(xì)胞毒性T細(xì)胞(cytotoxicTlymphocyte,CTL)應(yīng)答為主的細(xì)胞免疫應(yīng)答，以達(dá)到清除肝細(xì)胞內(nèi)病毒的目的。 本實(shí)驗(yàn)選取adr亞型乙肝病毒DNA作為擴(kuò)增模板，擴(kuò)增獲得編碼HBV核心抗原(HBVcoreantigen,HBc)1-78aa、HBc79-149aa、preS1抗原10-50aa、preS2抗原110-154aa及S抗原101-157aa的五個(gè)基因片段。通過(guò)將HBc1-78a

7、a和HBc79-149aa兩個(gè)基因片段酶切連接并插入質(zhì)粒pPIC3.5k構(gòu)建了以HBc為呈現(xiàn)載體的酵母表達(dá)質(zhì)粒pPIC3.5kHBc。將擴(kuò)增獲得的preS1、preS2和S三個(gè)基因片段插入質(zhì)粒pGEM-T/HBc2獲得融合基因片段S1C、S2C和SC，之后將融合基因片段插入質(zhì)粒pPIC3.5k，構(gòu)建了酵母表達(dá)質(zhì)粒pPIC3.5kHBcS1、pPIC3.5kHBcS2和pPIC3.5kHBcS。 將表達(dá)質(zhì)粒pPIC3.5kHBcA

8、、pPIC3.5kHBcS1和pPIC3.5kHBcS2以SalI核酸內(nèi)切酶線形化，電穿孔轉(zhuǎn)化GS115酵母細(xì)胞，利用無(wú)氨基酸的酵母含氮堿基作為唯一氮源篩選獲得陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。通過(guò)G418加壓篩選，獲取了可以高效表達(dá)融合蛋白的多拷貝整合菌株。 對(duì)篩選出的多拷貝整合菌株進(jìn)行甲醇利用表型鑒定，全部菌株均為甲醇利用正常型(Mut+)。對(duì)所選菌株提取酵母基因組DNA，以PCR方法鑒定轉(zhuǎn)化子，確定全部菌株均整合了酵母表達(dá)質(zhì)粒。 本研究