血清膽堿酯酶的分離純化及其在農(nóng)藥殘留快速檢測中的應(yīng)用.pdf

1、當(dāng)前，農(nóng)產(chǎn)品的病蟲害防治仍以化學(xué)防治為主，有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥仍然是目前在蔬菜、糧食等作物上使用最廣泛的農(nóng)藥。隨著病蟲害抗藥性的逐年增加，農(nóng)藥用量越來越大，施藥次數(shù)更加頻繁，使農(nóng)藥殘留問題更加突出，食用農(nóng)藥超標(biāo)的蔬菜、水果等而發(fā)生食物中毒的事件時有發(fā)生。因此，建立一套簡便、快速、準(zhǔn)確、能在農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)和流通各環(huán)節(jié)現(xiàn)場檢測的農(nóng)藥殘留檢測方法，控制“超毒”果蔬流入市場已成為急待解決的問題。該課題在前人研究的基礎(chǔ)上，對農(nóng)藥殘留快速檢測方法—

2、—膽堿酯酶抑制法進(jìn)行了研究。 酶抑制法理論基礎(chǔ)是有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥能抑制動物體內(nèi)膽堿酯酶(Cholinesterase，ChE)的活性，在一定條件下，ChE的活性變化與有機(jī)磷農(nóng)藥的濃度存在良好的相關(guān)性，從而通過測定農(nóng)產(chǎn)品的農(nóng)藥殘留提取液對ChE酶活力的影響即可判定農(nóng)藥殘留的情況。該課題從酶源的篩選入手，獲得一種來源廣泛、廉價、對常見有機(jī)磷及氨基甲酸酯類農(nóng)藥敏感的血清膽堿酯酶，并對該酶的純化方法和基本酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究，在此

3、基礎(chǔ)上，建立了兩種快速檢測方法：比色法和試紙法。研究結(jié)果如下： 通過對6種不同動物組織的膽堿酯酶的比較研究，最終選擇以A血清BChE作為農(nóng)藥殘留的檢測用酶。該酶經(jīng)過兩次硫酸銨鹽析、DEAE-52離子交換層析和SephadexG-200凝膠過濾層析后，其比活力由21.5U/mg提高到5944.1U/mg，純化278.5倍，回收率為17.8％，達(dá)到電泳純。該酶的Km=2.4×10-5，碘化硫代丁酰膽堿對該酶沒有過量底物抑制現(xiàn)象，最適

4、反應(yīng)溫度為37℃，最適反應(yīng)pH值為7.5～8.0；該酶熱穩(wěn)定性較好，在37℃～40℃保溫60min，酶活力基本不變，敵敵畏(DDVP)對該酶的IC50為0.001mg/kg。 在此基礎(chǔ)上，建立了兩種農(nóng)藥殘留的快速檢測方法。①比色法：以碘化硫代丁酰膽堿(BTChI)為底物，5-5’-二硫代-二硝基苯甲酸(DTNB)為顯色劑，412nm比色測定吸光值變化，計算膽堿酯酶的抑制率，進(jìn)而推算農(nóng)藥殘留情況。當(dāng)抑制率大于35％時，表明農(nóng)藥含量