OsRMC基因調(diào)控水稻根生長(zhǎng)發(fā)育的機(jī)理研究.pdf

1、實(shí)驗(yàn)室前期工作證明OsRAA1在玉米泛素啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下組成型表達(dá)，可以抑制水稻初生根的生長(zhǎng)，促進(jìn)不定根的形成，形成不同程度螺旋狀的初生根，根的向地性反應(yīng)減緩，這些表型和野生型水稻用生長(zhǎng)素處理的表型類(lèi)似，而且OsRAA1基因的轉(zhuǎn)錄受生長(zhǎng)素誘導(dǎo)，這些結(jié)果表明OsRAA1可能參與了生長(zhǎng)素的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。但這些表型產(chǎn)生的機(jī)理還不是很清楚。在水稻中，茉莉酸在根發(fā)育過(guò)程中的作用多為生理實(shí)驗(yàn)的報(bào)道；擬南芥中的研究表明生長(zhǎng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和茉莉酸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)可能都

2、受26S蛋白酶體的調(diào)控。由此我們推測(cè)茉莉酸在根的發(fā)育過(guò)程中可能也起著同樣的促進(jìn)作用。本論文在超表達(dá)OsRAA1水稻基礎(chǔ)上旨在克隆新基因，并對(duì)新基因功能進(jìn)行研究，以探討茉莉酸在水稻根發(fā)育過(guò)程中的分子機(jī)理，并對(duì)生長(zhǎng)素和茉莉酸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)系進(jìn)行探討。
　　 首先運(yùn)用雙向電泳技術(shù)結(jié)合質(zhì)譜分析技術(shù)，在超表達(dá)OsRAA1水稻背景下發(fā)現(xiàn)了受體激酶家族DUF26的一個(gè)成員明顯下調(diào)，我們命名為OsRMC(Oryzasativa Root Mean

3、der and Curling，AAL87185)，Western雜交進(jìn)一步證明了這個(gè)結(jié)果。
　　 OsRMC位于4號(hào)染色體，信息學(xué)分析表明只有一個(gè)拷貝，沒(méi)有內(nèi)含子，ORF閱讀框?yàn)?77bp，編碼的蛋白分子量為27.9 kDa，等電點(diǎn)(pI)為5.01。對(duì)該蛋白進(jìn)行同源性比較發(fā)現(xiàn)，其含有2個(gè)C-X8-C-X2-C基序(Cys-rich repeat，CRR)即半胱氨酸富集區(qū)，其中第四個(gè)半胱氨酸殘基不保守，該基序會(huì)形成二硫鍵，編碼

4、兩個(gè)未知功能的DUF26(Domain Unknown Function26)結(jié)構(gòu)域。OsRMC由一個(gè)信號(hào)肽和兩個(gè)CRR區(qū)組成，但沒(méi)有跨膜區(qū)和激酶區(qū)。RT-PCR顯示OsRMC可能是組成型表達(dá)的基因；亞細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明OsRMC是膜定位的蛋白。Western blot顯示OsRMC受茉莉酸誘導(dǎo)表達(dá)，受生長(zhǎng)素的抑制。
　　 RNAiOsRMC轉(zhuǎn)基因水稻在暗處培養(yǎng)時(shí)，抑制了初生根的生長(zhǎng)，使側(cè)根數(shù)目減少，但促進(jìn)了不定根的生長(zhǎng)和數(shù)目的增加；

5、第二葉鞘變短，這些表型和前人報(bào)道的外源茉莉酸處理野生型的表型一致。轉(zhuǎn)基因?qū)ιL(zhǎng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和合成沒(méi)有影響，但初生根和第二葉鞘對(duì)外源茉莉酸更加敏感，說(shuō)明RNAiOsRMC轉(zhuǎn)基因水稻可能增強(qiáng)了榮莉酸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。分析轉(zhuǎn)基因水稻的茉莉酸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑部分相關(guān)基因的表達(dá)變化，根中受茉莉酸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)特異誘導(dǎo)的病原相關(guān)基因RSOsPR10的表達(dá)明顯增多，而JAmyb和OsNDPK1的表達(dá)沒(méi)有變化，證實(shí)轉(zhuǎn)基因增強(qiáng)了茉莉酸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)其中的一個(gè)路徑；進(jìn)一步分析茉

6、莉酸合成途徑12-OXO-PDA(12-氧代-順，順-10，15-植物二烯酸)還原酶基因OsOPR的表達(dá)發(fā)現(xiàn)與野生型沒(méi)有明顯差別，說(shuō)明轉(zhuǎn)基因可能沒(méi)有影響體內(nèi)的茉莉酸合成途徑。RNAiOsRMC轉(zhuǎn)基因水稻的初生根比野生型的更容易發(fā)生彎曲，實(shí)驗(yàn)表明培養(yǎng)過(guò)程中茉莉酸和背觸反應(yīng)(negative thigmotropism)共同作用使轉(zhuǎn)基因的初生根更容易發(fā)生卷曲，而光信號(hào)會(huì)增強(qiáng)卷曲程度。但RNAiOsRMC轉(zhuǎn)基因水稻并沒(méi)有影響根的向地性，暗示R

7、NAiOsRMC轉(zhuǎn)基因可能增強(qiáng)了根的回旋運(yùn)動(dòng)或(和)背觸反應(yīng)，從而促進(jìn)了根的彎曲和卷曲。這些結(jié)果證明OsRMC參與的茉莉酸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程在水稻根的發(fā)育、彎曲和卷曲過(guò)程中起著重要的促進(jìn)作用。通過(guò)對(duì)超表達(dá)OsRAA1和RNAiOsRMC轉(zhuǎn)基因水稻的分析，說(shuō)明水稻中存在著生長(zhǎng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)促進(jìn)茉莉酸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的途徑。
　　 綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果認(rèn)為，OsRAA1調(diào)控了受體激酶家族DUF26的一個(gè)成員OsRMC，使其表達(dá)量降低，該過(guò)程增強(qiáng)了茉莉酸信