榨菜瘤狀莖生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控的分子機(jī)理研究.pdf

1、榨菜(Brassica juncea Coss.var.tumida Tsen et Lee)屬于十字花科蕓薹屬芥菜種莖瘤芥變種，其膨大的肉質(zhì)瘤狀莖是生產(chǎn)榨菜的原材料，是我國(guó)的特產(chǎn)蔬菜。本文以榨菜為材料，通過(guò)研究細(xì)胞分裂和核內(nèi)再?gòu)?fù)制在榨菜莖生長(zhǎng)發(fā)育中的變化規(guī)律及其分子調(diào)控機(jī)制，探索其在瘤狀莖生長(zhǎng)發(fā)育中的作用;通過(guò)對(duì)推測(cè)親本的RBR基因在榨菜中的遺傳模式及在瘤狀莖生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的時(shí)空表達(dá)變化研究，初步分析了RBR基因在榨菜瘤狀莖生長(zhǎng)發(fā)育中

2、的作用;另外，通過(guò)對(duì)環(huán)境（光周期和溫度）調(diào)控榨菜莖生長(zhǎng)發(fā)育的細(xì)胞學(xué)及分子機(jī)理研究，進(jìn)一步明確榨菜瘤狀莖膨大生長(zhǎng)發(fā)育的機(jī)制;最后通過(guò)雙向電泳篩選榨菜瘤狀莖膨大生長(zhǎng)發(fā)育的關(guān)鍵蛋白，在此基礎(chǔ)上初步探討了DNA甲基轉(zhuǎn)移酶基因的作用。所得主要結(jié)果如下:
　　 (1)研究了細(xì)胞分裂及核內(nèi)再?gòu)?fù)制在榨菜莖生長(zhǎng)發(fā)育中的作用及其分子調(diào)控機(jī)制。結(jié)果表明榨菜旺盛膨大莖的空間DNA相對(duì)含量分析顯示莖不同區(qū)域的細(xì)胞倍性呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)變化，外髓區(qū)2C和4C占主導(dǎo)地

3、位，但是隨著4C細(xì)胞比例的下降，8C細(xì)胞劇烈上升并在內(nèi)髓區(qū)域占主導(dǎo)地位。另外，對(duì)14條細(xì)胞周期基因和4條細(xì)胞膨大基因的克隆及他們?cè)谂虼笄o的不同部位的轉(zhuǎn)錄水平變化研究表明大部分細(xì)胞周期相關(guān)基因在P2和P3區(qū)域表達(dá)量相對(duì)較高，而S/G2，G2/M期調(diào)控基因在P5、P6區(qū)域顯著下降，而一些G1/S期基因在P5區(qū)出現(xiàn)另一個(gè)表達(dá)峰值。巧合的是，在核內(nèi)再?gòu)?fù)制程度很高的區(qū)域(P5)，BjXTH1和BjXTH2表達(dá)量劇烈增加。因此，莖的外部髓細(xì)胞可能具

4、有旺盛的分裂能力從而是莖膨大的細(xì)胞數(shù)目增長(zhǎng)來(lái)源;而核內(nèi)再?gòu)?fù)制可能與內(nèi)部髓細(xì)胞的膨大具有密切相關(guān)性;BjXTH1和BjXTH2可能在莖細(xì)胞膨大特別是髓部細(xì)胞的膨大中起重要作用，從而在榨菜莖的發(fā)育過(guò)程發(fā)揮重要作用。
　　 (2)研究了RBR基因在榨菜中的遺傳模式及其在瘤狀莖生長(zhǎng)發(fā)育中的作用。結(jié)果表明兩個(gè)推測(cè)親本各自具有兩類RBR基因，其氨基酸序列具有90-91％的相似性，4條基因都在榨菜中都保留下來(lái)，且在芥菜異源四倍體形成后獨(dú)立進(jìn)化

5、，但是兩類RBR基因在榨菜中序列上發(fā)生著不同程度的變異。另外，發(fā)現(xiàn)其推測(cè)親本的RBR1類基因（BrRBR1、BnRBR1）發(fā)生選擇性剪切現(xiàn)象，產(chǎn)生兩個(gè)具有不同C端的氨基酸序列，并且這種現(xiàn)象在榨菜中保留下來(lái)。RBR1類基因（BjRBR1、BjRBR2）在榨菜莖膨大旺盛的時(shí)期(Ⅲ、Ⅳ)表達(dá)量最高，RBR2類基因（BjRBR3、BjRBR4）在不同發(fā)育時(shí)期表達(dá)水平變化不大，表現(xiàn)出組成型表達(dá)模式。而B(niǎo)jRBR1-4在膨大莖的不同部位表達(dá)模式幾乎

6、一致，即都在細(xì)胞分裂旺盛區(qū)(P2、P3)表達(dá)量明顯降低，但在核內(nèi)復(fù)制區(qū)域(P5)表達(dá)量升高。因此，BjRBR1-4在榨菜瘤狀莖膨大過(guò)程中的細(xì)胞分裂和核內(nèi)再?gòu)?fù)制中可能發(fā)揮著不同的作用，參與調(diào)控瘤狀莖的膨大生長(zhǎng)。
　　 (3)研究了光周期及溫度調(diào)控榨菜瘤狀莖生長(zhǎng)發(fā)育的細(xì)胞學(xué)及分子機(jī)理。結(jié)果表明光周期和溫度共同決定榨菜瘤狀莖的膨大，而溫度影響瘤的形態(tài)。膨大莖(S4W/12)和未膨大莖(S4W/25)的解剖結(jié)構(gòu)表明細(xì)胞數(shù)目而不是細(xì)胞體積

7、是決定莖膨大的關(guān)鍵因素之一，而膨大莖的細(xì)胞主要來(lái)源于外髓區(qū)的細(xì)胞分裂活動(dòng)。通過(guò)對(duì)膨大莖和未膨犬莖中細(xì)胞周期相關(guān)基因、細(xì)胞膨大相關(guān)基因的定量分析，結(jié)果表明大部分細(xì)胞周期的正向調(diào)控因子:G1/S期（BjE2Fa、BjE2Fb）和G2/M期（BjCYCA2;3、BjCYCA3;1、BjCDKB2;1、BjCDKB2;2、BjCKS2、）以及BjXTH1和BjXTH2在膨大莖中的表達(dá)量均要高于未膨大莖，說(shuō)明了膨大莖中旺盛的細(xì)胞活動(dòng)。因此，光周期

8、和溫度可能影響了榨菜莖中外髓區(qū)細(xì)胞的命運(yùn)，使其具有分裂能力，從而導(dǎo)致榨菜瘤狀莖的膨大生長(zhǎng)。
　　 (4)通過(guò)雙向電泳篩選莖膨大相關(guān)的蛋白，結(jié)果表明這些蛋白質(zhì)主要參與植物抗逆反應(yīng)，氧化還原途徑(reactive oxygen species，ROS)，糖酵解反應(yīng)等，其中SAMS（腺苷甲硫氨酸合成酶）引起我們的興趣。在榨菜莖膨大初期，200 mM甲硫氨酸溶液處理榨菜植株，明顯抑制了瘤狀莖的生長(zhǎng)發(fā)育。另外克隆并研究了DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶