榨菜瘤狀莖生長發(fā)育調(diào)控的分子機理研究.pdf

1、榨菜(Brassica juncea Coss.var.tumida Tsen et Lee)屬于十字花科蕓薹屬芥菜種莖瘤芥變種，其膨大的肉質(zhì)瘤狀莖是生產(chǎn)榨菜的原材料，是我國的特產(chǎn)蔬菜。本文以榨菜為材料，通過研究細胞分裂和核內(nèi)再復制在榨菜莖生長發(fā)育中的變化規(guī)律及其分子調(diào)控機制，探索其在瘤狀莖生長發(fā)育中的作用;通過對推測親本的RBR基因在榨菜中的遺傳模式及在瘤狀莖生長發(fā)育過程中的時空表達變化研究，初步分析了RBR基因在榨菜瘤狀莖生長發(fā)育中

2、的作用;另外，通過對環(huán)境（光周期和溫度）調(diào)控榨菜莖生長發(fā)育的細胞學及分子機理研究，進一步明確榨菜瘤狀莖膨大生長發(fā)育的機制;最后通過雙向電泳篩選榨菜瘤狀莖膨大生長發(fā)育的關鍵蛋白，在此基礎上初步探討了DNA甲基轉移酶基因的作用。所得主要結果如下:
　　 (1)研究了細胞分裂及核內(nèi)再復制在榨菜莖生長發(fā)育中的作用及其分子調(diào)控機制。結果表明榨菜旺盛膨大莖的空間DNA相對含量分析顯示莖不同區(qū)域的細胞倍性呈現(xiàn)動態(tài)變化，外髓區(qū)2C和4C占主導地

3、位，但是隨著4C細胞比例的下降，8C細胞劇烈上升并在內(nèi)髓區(qū)域占主導地位。另外，對14條細胞周期基因和4條細胞膨大基因的克隆及他們在膨大莖的不同部位的轉錄水平變化研究表明大部分細胞周期相關基因在P2和P3區(qū)域表達量相對較高，而S/G2，G2/M期調(diào)控基因在P5、P6區(qū)域顯著下降，而一些G1/S期基因在P5區(qū)出現(xiàn)另一個表達峰值。巧合的是，在核內(nèi)再復制程度很高的區(qū)域(P5)，BjXTH1和BjXTH2表達量劇烈增加。因此，莖的外部髓細胞可能具

4、有旺盛的分裂能力從而是莖膨大的細胞數(shù)目增長來源;而核內(nèi)再復制可能與內(nèi)部髓細胞的膨大具有密切相關性;BjXTH1和BjXTH2可能在莖細胞膨大特別是髓部細胞的膨大中起重要作用，從而在榨菜莖的發(fā)育過程發(fā)揮重要作用。
　　 (2)研究了RBR基因在榨菜中的遺傳模式及其在瘤狀莖生長發(fā)育中的作用。結果表明兩個推測親本各自具有兩類RBR基因，其氨基酸序列具有90-91％的相似性，4條基因都在榨菜中都保留下來，且在芥菜異源四倍體形成后獨立進化

5、，但是兩類RBR基因在榨菜中序列上發(fā)生著不同程度的變異。另外，發(fā)現(xiàn)其推測親本的RBR1類基因（BrRBR1、BnRBR1）發(fā)生選擇性剪切現(xiàn)象，產(chǎn)生兩個具有不同C端的氨基酸序列，并且這種現(xiàn)象在榨菜中保留下來。RBR1類基因（BjRBR1、BjRBR2）在榨菜莖膨大旺盛的時期(Ⅲ、Ⅳ)表達量最高，RBR2類基因（BjRBR3、BjRBR4）在不同發(fā)育時期表達水平變化不大，表現(xiàn)出組成型表達模式。而BjRBR1-4在膨大莖的不同部位表達模式幾乎

6、一致，即都在細胞分裂旺盛區(qū)(P2、P3)表達量明顯降低，但在核內(nèi)復制區(qū)域(P5)表達量升高。因此，BjRBR1-4在榨菜瘤狀莖膨大過程中的細胞分裂和核內(nèi)再復制中可能發(fā)揮著不同的作用，參與調(diào)控瘤狀莖的膨大生長。
　　 (3)研究了光周期及溫度調(diào)控榨菜瘤狀莖生長發(fā)育的細胞學及分子機理。結果表明光周期和溫度共同決定榨菜瘤狀莖的膨大，而溫度影響瘤的形態(tài)。膨大莖(S4W/12)和未膨大莖(S4W/25)的解剖結構表明細胞數(shù)目而不是細胞體積

7、是決定莖膨大的關鍵因素之一，而膨大莖的細胞主要來源于外髓區(qū)的細胞分裂活動。通過對膨大莖和未膨犬莖中細胞周期相關基因、細胞膨大相關基因的定量分析，結果表明大部分細胞周期的正向調(diào)控因子:G1/S期（BjE2Fa、BjE2Fb）和G2/M期（BjCYCA2;3、BjCYCA3;1、BjCDKB2;1、BjCDKB2;2、BjCKS2、）以及BjXTH1和BjXTH2在膨大莖中的表達量均要高于未膨大莖，說明了膨大莖中旺盛的細胞活動。因此，光周期

8、和溫度可能影響了榨菜莖中外髓區(qū)細胞的命運，使其具有分裂能力，從而導致榨菜瘤狀莖的膨大生長。
　　 (4)通過雙向電泳篩選莖膨大相關的蛋白，結果表明這些蛋白質(zhì)主要參與植物抗逆反應，氧化還原途徑(reactive oxygen species，ROS)，糖酵解反應等，其中SAMS（腺苷甲硫氨酸合成酶）引起我們的興趣。在榨菜莖膨大初期，200 mM甲硫氨酸溶液處理榨菜植株，明顯抑制了瘤狀莖的生長發(fā)育。另外克隆并研究了DNA甲基化轉移酶