shRNA-DCN調(diào)控鴨肌肉生長(zhǎng)發(fā)育的分子機(jī)制研究.pdf

1、核心蛋白聚糖(Decorin)是存在于細(xì)胞外基質(zhì)中的硫酸軟骨素蛋白聚糖家族的一員，在肌肉細(xì)胞分化、遷移和調(diào)節(jié)結(jié)締組織形成的過程中發(fā)揮著重要的作用。肌肉的生長(zhǎng)發(fā)育與蛋白代謝過程密切相關(guān)，多種細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與了肌肉蛋白代謝過程。哺乳動(dòng)物中的研究表明，Decorin是TGF-β的胞外配體，可通過該信號(hào)通路影響細(xì)胞的分化和轉(zhuǎn)移。DCN通過抑制MSTN來促進(jìn)細(xì)胞的增殖和分化，還能夠通過抑制IGF1R的活性、激活A(yù)KT等調(diào)控肌肉的生長(zhǎng)發(fā)育。在鴨

2、中，DCN是否可通過TGF-β/Smad和IGF1/PI3K/AKT/MTOR通路來實(shí)現(xiàn)對(duì)肌肉生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控過程，目前還不明確。因此，本研究通過構(gòu)建DCN基因的干擾載體，分別將其轉(zhuǎn)染至鴨成肌細(xì)胞及雛鴨腿肌中，同時(shí)采用PI3K基因的激活劑重組人胰島素樣生長(zhǎng)因子□（Recombinant human insulin-like growth factors□，RH IGF1）處理鴨成肌細(xì)胞。通過用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞的活性，用組織石蠟切片法觀

3、察肌肉的生長(zhǎng)發(fā)育狀態(tài)，分別用qRT-PCR法和ELISA法檢測(cè)TGF-β/Smad和IGF1/PI3K/AKT/MTOR信號(hào)通路中基因的表達(dá)量，以期得到沉默DCN基因在細(xì)胞和個(gè)體水平上對(duì)鴨肌肉生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控及其途徑。主要試驗(yàn)結(jié)果如下:
　　(1)構(gòu)建了鴨DCN基因干擾載體shRNA1、shRNA2、shRNA3和陰性對(duì)照載體shConrol。轉(zhuǎn)染至鴨成肌細(xì)胞后，成功篩選出干擾效果較好的載體shRNA3和最佳轉(zhuǎn)染時(shí)間24h。qRT-

4、PCR和ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，在鴨成肌細(xì)胞和雛鴨腿肌中轉(zhuǎn)染該干擾載體可使DCN得到抑制。鴨DCN基因的shRNA最佳干擾序列為5'CGCAGACACCAACATTACTAG3’。
　　(2)分別用shRNA-DCN和shControl處理鴨成肌細(xì)胞，培養(yǎng)24h后用qRT-PCR和ELISA法檢測(cè)相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)量。結(jié)果顯示shRNA-DCN處理組與shControl處理組相比，成肌細(xì)胞的活性明顯下降，且IGF1R、PI3K、

5、AKT、MTOR、p70S6K、MYOD、TGF-β R1和Smad4基因以及Decorin、PI3K、TOR、TGF-βR1和Smad2蛋白表達(dá)量顯著降低(P＜0.05)。表明沉默DCN基因可通過IGF1/PI3K/AKT/MTOR/p70S6K信號(hào)通路和TGF-β/Smad信號(hào)通路抑制鴨成肌細(xì)胞的增殖。
　　(3)用shRNA-DCN處理鴨成肌細(xì)胞，同時(shí)向培養(yǎng)液中添加RH IGF1(20ng/mL)，培養(yǎng)24小時(shí)后用qRT-P

6、CR和ELISA法檢測(cè)相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與shRNA-DCN處理組相比，shRNA-DCN+IGF1處理組中成肌細(xì)胞的活性明顯增加，且GF1 R、AKT、MTOR、p70S6K和Smad基因以及Decorin、PI3K、MTOR、TGF-βR1和Smad2蛋白的表達(dá)量顯著升高(p＜0.05)。表明RH IGF1可通過IGF1/PI3K/AKT/MTOR/p70S6K信號(hào)通路和TG F-β/Smad信號(hào)通路緩解DCN基因沉